ACE和ACE Excel硅膠基質(zhì)固定相幾乎消除了硅醇基對(duì)色譜分離的不利影響，并且在為堿性化合物提供zhuo越峰形方面贏得了口碑。

峰拖尾可以降低分離度，降低靈敏度，甚至干擾準(zhǔn)確度和精密度（圖4）。

峰拖尾有許多潛在的原因，但分離堿性物質(zhì)時(shí)的主要原因是硅膠固定相載體顆粒表面上的酸性硅醇基與分析物上的氨基之間的相互作用（圖5）。

圖 4：峰拖尾對(duì)分離度和靈敏度的影響

隨著峰拖尾（Tf，拖尾因子）從1.0增加到2.0，分離度（Rs）從1.5下降到0.87。

由于峰寬增加以及峰面積保持不變，靈敏度（峰高）也隨著峰拖尾的增加而下降。

ACE色譜柱采用具有極低硅醇活性的超惰性硅膠制成。

這種超純硅膠采用ZL技術(shù)進(jìn)行有效鍵合和徹底封尾。

導(dǎo)致這種硅膠基質(zhì)的固定相幾乎消除了硅醇基對(duì)色譜分離的不利影響。

ACE色譜柱的超惰性特性使其成為分離極性堿性化合物的理想選擇。

當(dāng)分離復(fù)雜堿性化合物時(shí),與其他現(xiàn)代堿性去活色譜柱相比，ACE色譜柱總是能給出明顯更好的峰形和柱效（圖6）。

圖 5：峰拖尾相互作用

硅膠固定相載體表面上的酸性硅醇基可形成與堿性化合物相互作用的離子交換位點(diǎn)。

這種離子交換的相互作用通常可以導(dǎo)致峰保留（二次保留），并當(dāng)采用反相HPLC分離胺類(lèi)化合物時(shí)引起峰拖尾。

一種幾乎消除了硅醇基對(duì)色譜分離不利影響的硅膠基質(zhì)固定相

圖 6：峰拖尾比較

條件
色譜柱尺寸：50 x 2.1 mm
流動(dòng)相：40％甲醇，60％水
流速：0.2 mL/min
溫度：22oC
樣品：吡啶

報(bào)告了堿性化合物（吡啶）在各種常見(jiàn)C18色譜柱上的塔板數(shù)。

在10％峰高下測(cè)量塔板數(shù)，以使峰拖尾納入在測(cè)量中。

ACE C18-PFP由于其超惰性性質(zhì)而達(dá)到了Z高塔板數(shù)。

利用ACE鍵合相的固定相選擇

分離度方程式可以確定影響分離度的參數(shù)：柱效（N）、容量因子（k）和選擇性（α）。

在過(guò)去幾年里，柱效和使用超GX色譜柱（被稱(chēng)為“UHPLC”色譜柱）作為實(shí)現(xiàn)分離目標(biāo)的手段已得到了極大的重視。

UHPLC已通過(guò)更快速的分離和更快速的方法開(kāi)發(fā)提高實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)力來(lái)證明了其價(jià)值。

然而，選擇性往往被忽視，且其重要性也被強(qiáng)調(diào)柱效所掩蓋。這是令人遺憾的。

在影響分離度的三個(gè)參數(shù)中，選擇性是Z為重要的。

（參見(jiàn)圖1）通過(guò)利用柱效和選擇性，通?？梢詫?shí)現(xiàn)更好和更快的分離。

圖 1：N、α和k對(duì)分離度（Rs）的影響

提高N，α或k可以提高分離度（Rs）。

然而，從這些圖中可以看出，隨著N或k值的提高，對(duì)分離度的改善效果也逐漸降低。

另一方面，提高選擇性（α）則沒(méi)有這個(gè)問(wèn)題，因此其成為開(kāi)發(fā)分離方法時(shí)的Z佳優(yōu)化變量。

在反相色譜中，固定相與分析物之間存在多種相互作用的機(jī)制，這可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。

這些相互作用機(jī)制包括：疏水性結(jié)合、π-π、氫鍵、偶極-偶極和形狀選擇性。

不同類(lèi)型的鍵合相將提供其中一種或多種相互作用機(jī)制。表1列出了ACE鍵合相和每種可能的主要相互作用機(jī)制，這取決于分析物和流動(dòng)相條件。

表1: 比較不同鍵合相的分離機(jī)制/相互作用                                                                                    

利用鍵合相的選擇性實(shí)現(xiàn)更好的分離。
圖2表明了兩種ACE鍵合相即C18-AR與苯基之間的選擇性差異。
盡管兩種鍵合相提供了強(qiáng)π-π和偶極-偶極相互作用的可能性，但是在其它可能的相互作用機(jī)制（特別是疏水性結(jié)合）的強(qiáng)度方面，它們存在顯著差異。

C18-AR可能具有其它不同的分離機(jī)制，可以為復(fù)雜的混合物帶來(lái)更好的分離效果。對(duì)于其他混合物，可能不是這種情況，這是ACE鍵合相的優(yōu)勢(shì)。

當(dāng)開(kāi)發(fā)分離方法時(shí)，ACE鍵合相可以提供各種可供選擇的重要保留機(jī)制。

非常強(qiáng)大且獨(dú)特的C18-AR和C18-PFP相只有在ACE和ACE Excel色譜柱中可以獲得。
通過(guò)利用柱效和選擇性，可以實(shí)現(xiàn)更好的分離。

圖 2：C18-AR與苯基相之間選擇性差異的比較

色譜柱尺寸： 50 x 2.1 mm, 3 μm
流動(dòng)相：

A= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于水中）；
B= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于甲醇/水中：65:35, v/v）
流速： 0.6 mL/min
溫度： 60 ℃
檢測(cè)： UV 214 nm
梯度： 5分鐘內(nèi)從3至B，并持續(xù)1分鐘。

樣品：
1. 甲硝唑
2. 3-羥基苯甲酸
3. 苯酚
4. 苯甲醇
5. 咖啡茵
6. 水楊酸
7. 喹喔啉
8. 苯甲酸
9. 奎寧
10. 非那西丁
11. 1,4-二硝基苯
12. 1,3,5-三硝基苯
13. 呋塞米
14. 1,3,5 -三甲氧基苯
15. 吡羅昔康
16. 卡維地洛
17. 苯甲酸乙酯
18. 去甲替林

C18-AR相的疏水性更大，這可以為色譜峰對(duì)（13,14）和（15,17）提供更多的保留值和更佳的選擇性。還要注意C18-AR與苯基相的洗脫順序有很多變化。

圖3給出了鍵合相選擇能力的另一實(shí)例。

一個(gè)分離是用C18鍵合相的UHPLC色譜柱完成，另一個(gè)分離是用C18-PFP鍵合相的UHPLC色譜柱完成。

C18-PFP鍵合相提供的額外分離機(jī)制，使得總體分離效果更佳出色。

圖 3：ACE Excel可以獲得zhuo越的分離度和峰形：藥物及其相關(guān)物質(zhì)的UHPLC結(jié)果

條件
色譜柱尺寸：50 x 2.1mm
流動(dòng)相：

A = 5mM甲酸（溶于水中）
B = 5mM甲酸（溶于甲醇中）
梯度：5分鐘內(nèi)從3至B
流速：0.6 mL/min
溫度：40 ℃
檢測(cè)：UV 254 nm

樣品
1. 對(duì)乙酰氨基酚
2. 氫氯噻嗪
3. 甲基苯基亞砜
4. 甲基苯砜

在C18 UHPLC色譜柱和C18-PFP色譜柱上同樣快速地產(chǎn)生色譜圖。

然而，C18-PFP色譜柱可以為色譜峰對(duì)（13,14）和（15,17）提供更佳的選擇性，因此能夠提供優(yōu)越的總體分離性能。

ACE色譜柱可以提供從UHPLC到HPLC再到制備型HPLC的易擴(kuò)展性。

相同的質(zhì)量控制，可以確保不同批次色譜柱的高重現(xiàn)性，也可以保證您更容易地在UHPLC和HPLC方法之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換，或需要分離和純化目標(biāo)化合物時(shí)放大到制備應(yīng)用上。

柱效當(dāng)然會(huì)改變，但可以預(yù)料的是，譜帶間距（選擇性）將相同。

圖14闡明了當(dāng)使用相同的ACE鍵合相但不同粒徑填充的色譜柱進(jìn)行操作時(shí)，可以預(yù)見(jiàn)到分析物一致的譜帶間距類(lèi)型（選擇性）。

圖 14：將ACE固定相從UHPLC（2μm）擴(kuò)展到HPLC（3μm和5μm）再至制備型HPLC（10μm）時(shí)，選擇性得到了保留與保證。

條件
流動(dòng)相：35:65 MeCN/0.1%TFA（溶于水中）
溫度：22 ℃
波長(zhǎng)：254 nm

分析物
1. 尿嘧啶
2. 4-羥基苯甲酸
3. 乙酰水楊酸
4. 苯甲酸
5. 2-羥基苯甲酸
6. 對(duì)羥基苯甲酸乙酯

試驗(yàn)樣品的這些色譜圖在填充有相同的鍵合相但不同粒徑的色譜柱上以相同的流動(dòng)相條件運(yùn)行，結(jié)果闡明分離從UHPLC擴(kuò)展到HPLC再到制備型HPLC的容易程度。

當(dāng)使用ACE Excel UHPLC色譜柱進(jìn)行快速方法開(kāi)發(fā)，且該方法必須可轉(zhuǎn)移到HPLC時(shí)，易擴(kuò)展性則顯得特別有價(jià)值。

圖 15：ACE固定相可以提供相同的選擇性，無(wú)論它們是UHPLC、HPLC還是制備型HPLC色譜柱

條件
色譜柱：2.1 x 50 mm
流動(dòng)相：1.4分鐘內(nèi)從30% B至90% B
A = 20mM甲酸銨+ 0.1％甲酸
B =乙腈+ 0.1％甲酸
梯度：在30％B時(shí)持續(xù)0.30分鐘，在1.10分鐘內(nèi)從30至90％B，在90％B時(shí)持續(xù)0.40分鐘
流速：0.5 mL/min
柱溫：30oC
檢測(cè)：AB Sciex Triple Quad（TM）5500 MS，以ESI（+）模式運(yùn)行
儀器：島津Prominence UFLC系統(tǒng)

分析物
1. 甲苯咪唑
2. 普羅替林
3. 阿米替林
4. 洛哌丁胺

試驗(yàn)樣品的這些色譜圖在ACE Excel C18 2μmUHPLC色譜柱、ACE C18 3μmHPLC色譜柱和ACE C185μm色譜柱上以相同的流動(dòng)相條件運(yùn)行，結(jié)果闡明ACE固定相的選擇性一致，無(wú)論填充粒徑如何。

這使得從UHPLC到HPLC或HPLC再到UHPLC的方法轉(zhuǎn)移更加容易。同時(shí)也使得從分析型應(yīng)用擴(kuò)展到制備型應(yīng)用更加容易。

峰形問(wèn)題                                   
                                                                         

柱子與柱子之間的可重現(xiàn)性受硅膠固定相載體的生成、固定相與固定相載體的鍵合以及色譜柱中固定相的填充的影響。

在色譜柱的制備過(guò)程中，每個(gè)階段被控制得越好，色譜柱的可重現(xiàn)性和質(zhì)量則越好。
ACE色譜柱在色譜柱制備過(guò)程中的每個(gè)階段均得到了全面控制。

這些控制措施確保ACE色譜柱在柱間以及批次之間產(chǎn)生可靠且可預(yù)測(cè)的性能。

圖13提供了典型批次驗(yàn)證測(cè)試的實(shí)例。

硅醇活性的細(xì)微變化是柱子與柱子之間選擇性變化的主要原因之一。

ACE和ACE Excel色譜柱由于使用超純?cè)噭┖蛧?yán)格的制造工藝控制（可以獲得具有均一表面特性的高純度硅膠固定相載體）而具有出色的可重現(xiàn)性。

將這種高純度硅膠與先進(jìn)的鍵合技術(shù)相結(jié)合，可以產(chǎn)生一系列高惰性的固定相，這些固定相幾乎消除了色譜中的硅醇干擾，從而提供zhuo越的柱子與柱子之間的可重現(xiàn)性。

液質(zhì)聯(lián)用儀方法開(kāi)發(fā)--舊的色譜柱有峰，同型號(hào)新的色譜柱不出峰是為啥？

液相色譜峰形前傾解決辦法是什么？

緩沖液或流動(dòng)相添加劑不足會(huì)導(dǎo)致峰拖尾。

緩沖液主要用來(lái)使樣品處于（保持）恒定的離子化狀態(tài)，從而穩(wěn)定保留情況（時(shí)間），并在Z大程度上減少因離子相互作用而導(dǎo)致的峰拖尾現(xiàn)象。

緩沖液還可YZ硅膠表面上的硅烷醇基團(tuán)的電離現(xiàn)象（的硅醇基離子化）。

但是對(duì)于低純度硅膠材料來(lái)說(shuō)，由于其硅烷醇更容易被電離，所以它的挑戰(zhàn)性更高（當(dāng)然，這對(duì)于低純度的硅膠材料是更大的挑戰(zhàn)，因?yàn)榭赡芨喙璐蓟鶗?huì)離子化的）。

添加劑濃度對(duì)峰形的影響如圖2所示。

在這種情況下，三氟乙酸（TFA）會(huì)作為蛋白質(zhì)樣品成分的離子對(duì)試劑，也會(huì)產(chǎn)生（可提供）低pH流動(dòng)相以YZ硅烷醇電離。

通常，0.1％TFA可以（作為添加劑）用于蛋白質(zhì)和肽分離。

如圖2a和b所示，該濃度足以在Z大程度上改善高純度和中純度硅膠柱的拖尾現(xiàn)象。

然而，如果TFA濃度下降（降低）十倍（圖2c，d），兩個(gè)相（兩個(gè)固定相）的拖尾均會(huì)隨之增加。高純度硅膠仍可（仍然）保持可接受的峰形，但中純度色譜柱的峰拖尾則無(wú)法接受。

緩沖液和其它流動(dòng)相添加劑的一個(gè)共同特征是：作用效果（例如峰拖尾的減少、保留時(shí)間的穩(wěn)定）會(huì)從低濃度開(kāi)始（開(kāi)始顯現(xiàn)），并隨著濃度的增加而繼續(xù)作用（增加），但會(huì)逐漸（趨平）維持在一個(gè)穩(wěn)定水平。

穩(wěn)定水平之下的添加劑濃度，可以保持穩(wěn)定的運(yùn)行；濃度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生（可能導(dǎo)致）溶解性問(wèn)題。

對(duì)于大多數(shù)應(yīng)用來(lái)說(shuō)，10-25mM內(nèi)的添加劑已經(jīng)足夠了，但Z好根據(jù)具體情況確定。

圖2. 緩沖液濃度對(duì)峰拖尾的影響。

0.1％TFA與（a）高純度（b）中純度硅膠柱；0.01％TFA與（c）高純度和（d）中純度硅膠柱。

色譜柱：250x4.6mm, 5m, C18 300?；

流動(dòng)相：A: 0.1%或0.01%的TFA溶于水中；B: 0.1%或0.01%的TFA溶于ACN；5-70% B，30分鐘；

流量：1.0 mL/min, 280nm。

成分（保留順序）：核糖核酸酶A、細(xì)胞色素C、全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白、脫輔基肌紅蛋白。