PCR簡介

聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR)是利用一段DNA為模板，在DNA聚合酶和核苷酸底物共同參與下，將該段DNA擴增至足夠數量，以便進行結構和功能分析的一種反應。

PCR擴增原理

核酸降解是DNA/RNA分子中的堿基和戊糖間的氮糖苷鍵，或磷酸二酯鍵在物理因素、化學因素和生物因素等作用下發(fā)生水解，使DNA/RNA鏈發(fā)生斷裂。

▲ 圖一：PCR原理反應示意圖

▲ 圖二：PCR反應過程中溫度變化圖

實時熒光定量PCR原理

通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時監(jiān)控反應過程，結合相應軟件可以對結果進行分析，通過標準曲線對未知模板進行定量分析，計算待測樣本的初始模板濃度。

?  初始DNA濃度越高，熒光達到某一值（閾值）時所需要的循環(huán)數越少（Cq值）。

?  Log濃度與循環(huán)數成線性關系，根據樣品擴增到閾值的循環(huán)數與已知起始拷貝數的標準品作出的標準曲線對比就可以計算出該樣品的起始拷貝數。

影響PCR擴增的因素

?  模板間的交叉污染。

?  PCR試劑的污染。

?  PCR產物的污染。

防止污染的預防操作

? 永遠要設置NTC（No Template Control）對照，一個不含有模板DNA但含有PCR體系中所有其他成分的對照。如果不能發(fā)現，會導致后續(xù)一系列的數據無法使用。

? 準備PCR體系的移液器要專用，千萬不能用吸取過PCR產物的移液器去準備PCR體系。

? 打開離心管前先離心，開管動作要輕，以防管內液體濺出。

? 在加完其他反應成分再加入模板。

? 實驗結束后及時清理臺面。

出現污染后的解決辦法

? 更換試劑：更換新的試劑和水，用確保無污染的移液器分裝備用。

? 清潔所有可能的污染源：實驗臺面，離心機，門把手等。

? 實驗過程更加小心，采用前面提到的各種防止污染的方法。

Cielo實時熒光定量PCR系統(tǒng)

Harness of the power of qPCR

?  數據可靠性：連續(xù)1000次實驗后，結果高度一致。

?  應用靈活性：提供多種qPCR應用分析。

?  流程智能化：中英文用戶界面，觸控操作，可多機聯用。

?  在線便捷性：主機可獨立運行qPCR程序，數據可USB、Wi-Fi等網絡傳輸。

做過PCR的小伙伴都知道，PCR前期的驗證引物探針性能和確定最適反應條件是確保正式實驗順利進行的前提。PCR實驗中有個相當重要的工作——即是PCR擴增效率的評估。擴增效率是PCR檢測性能最重要的指標之一，也是定量分析計算結果時所需要的參數。接下來，讓小編給大家細細說來吧。

什么是擴增效率

PCR是一種DNA體外擴增技術，通常包括了30 - 50個循環(huán)周期。每個循環(huán)中，目標DNA分子的拷貝數最多會增加1倍。但在實際反應中，1個DNA分子在1個擴增循環(huán)后被成功復制的概率，也就是擴增效率E<1。而PCR的特點是反應初期目標DNA分子呈現指數增長，這個階段的擴增效率可以無限接近于1；隨后由于反應組分消耗或聚合酶活性下降或兩者共同作用，導致反應效率逐漸下降并ZZ停止。不管是定量DNA分子初始量，還是計算表達量差異，都需要精確評估PCR擴增效率。

如何評估擴增效率

標準曲線是評估PCR擴增效率最可靠和穩(wěn)定的一種方法，被研究者們廣泛認可。該方法涉及到制作一系列的樣品來控制目標模板的相對數量。這些樣品通常由濃縮的原液連續(xù)稀釋而成，最常用的是10倍稀釋。使用一系列稀釋樣品，采用標準qPCR程序進行擴增獲得Cq值，ZH根據各樣品濃度及相應的Cq值繪制標準曲線，得到線性方程Cq= -klgX0+b，擴增效率E=10(-1/k)-1。利用qPCR進行定量分析時，要求擴增效率范圍在90%-110%（3.6＞k＞3.1）。

影響擴增效率的關鍵因素

PCR的效率取決于許多因素，包括以下方面：

1）檢測的性能。這取決于引物、模板的序列和結構。二級結構和分子間的相互作用都會降低PCR效率。

2）樣品基質。其中可能含有來自樣品的YZ劑和其他干擾物質，或攜帶來自上游加工步驟的試劑。檢測樣品是否有YZ作用，可使用RNA或DNA Spikes方法進行檢測，或者通過倍比稀釋得到標準曲線也可以觀察到。

3）所用試劑及其濃度。本質上，任何PCR試劑都會一定程度上限制PCR反應速率和性能。

4）競爭性反應。多重反應時，各基因的擴增存在反應成分的競爭。

5）qPCR儀器。由于儀器特定的硬件/軟件屬性和設置、以及用于提取Cq值的特定算法不同，相同的實驗中，不同的儀器會產生不同的PCR效率。

6）技術重復。一般進行3次以上的技術重復以校正實驗誤差，重復數越多精確度越高。

7）連續(xù)稀釋中的移液體積。移液體積越大，移液器誤差或操作誤差引起的影響越小。

qPCR擴增效率的判斷

qPCR擴增效率主要是通過標準曲線的線性關系方程Cq=-klgX0+b來判斷，擴增效率E在90%-110%之間時，認為擴增接近理想情況；參數R2要求≥0.98，R2越接近1，則說明Cq和X0的Log值之間的相關性越高。

那么擴增效率E表現不好，主要分為兩種情況：

1）過低的擴增效率（<90％）

可能存在的原因：

? 移液器校準不良或移液技術差。

? 不正確的稀釋導致標準曲線出現錯誤。

? 染料濃度低熒光或者儀器未校準染料。

? 引物設計不好或擴增子具有二級結構。

? 標準曲線動態(tài)范圍太小。

? Taq酶無活性或活性降低。

? 樣品YZ。

2）過高的擴增效率（> 110％）

可能存在的原因：

? 移液器校準不良或移液技術差。

? 不正確的稀釋導致標準曲線出現錯誤。

? 引物二聚體或非特異性擴增。

? 標準曲線動態(tài)范圍太小。

? 基因組DNA污染（僅限RNA模板未進行DNase I處理或DNase I消化不完全）。

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1、為什么實時熒光PCR法要用質控

由于在樣本處理、核酸提取、PCR擴增整個過程中存在試劑/設備不穩(wěn)定、核酸提取效率低、樣本交叉污染等問題，所以需要設置質控體系監(jiān)控核酸提取和PCR擴增全過程。質控體系可以降低實驗誤差，保證樣本檢測的準確性，同時避免檢測過程中的假陰性和假陽性。

2、質控體系質控品的組成

陽性對照（PC）：監(jiān)控系統(tǒng)故障，一般為含目的成分或片段的質粒。

陰性對照（NC）：監(jiān)控反應體系污染情況，一般為不含目的成分或片段的質粒。

無模板對照（NTC）：監(jiān)控反應體系污染情況，一般為去離子水。

內標（內參）：校準生物學誤差，判斷核酸提取有效性及擴增效率。

重復實驗：降低其余誤差，一般為2-3次以上。

GB∕T38164-2019 動物源性成分檢測方法質控品設置示例

動物源性檢測操作中對內參基因18SrRNA進行檢測的方法可在第二通道中進行設置。單通道產品則可在B槽中進行，設置同A槽。 

3、質控體系設置要求及過程控制

一般無特殊要求的實驗需要設置陰陽性對照，如非洲豬瘟病毒檢測（TCVMA 5-2018），食源性致病菌檢測等（SNT1870-2016），要求嚴格的實驗還需設置內參并進行2-3個平行實驗，如動物源性檢測（GB∕T38164-2019），轉基因定量實驗等（GBT19495.5-2018）。

對于涉及人體樣本的臨床診斷而言，除質控品設置外，還需對整個核酸提取和PCR擴增過程進行質量控制。如諾如病毒檢測（GB 4789.42-2016），新冠病毒檢測等。

在實際實驗過程中，需綜合考慮實驗環(huán)境、操作流程、實驗成本等實際條件，以便選擇適宜的方法進行質量控制。

（1）擴增控制示例（A5-A7）

GB 4789.42-2016 諾如病毒檢驗 擴增控制示例

規(guī)則：YZ指數<2.00，擴增實驗成立，反之，則反應無效。

方法：YZ指數=A6Ct值-A5Ct值，滿足條件，則使用A1孔Ct值作為結果；若不滿足，則判斷A7Ct值-A5Ct值，滿足條件后則使用A2孔Ct值作為結果；若兩個反應孔YZ指數均≥2.00，則反應無效。（反應結果為陽性時也可酌情判定為陽性）

（2） 核酸提取過程控制（A8-B4）

GB 4789.42-2016 諾如病毒檢驗 核酸提取過程控制示例

規(guī)則：若核酸提取效率≥1%，則核酸提取有效。若提取效率<1%，則需重新檢測（反應結果為陽性時也可酌情判定為陽性）

方法：通過B1-B4孔建立標準曲線（PC2濃度為1）。核酸提取效率=A8孔Ct值對應的濃度×100%。

4、實時熒光PCR法診斷試驗的評價指標

（1）真實性評價

①：靈敏度：也稱真陽性率，即實際有病且按該診斷試驗被正確地判為有病的概率。

②：特異性：也稱真陰性率，即實際無病按該診斷試驗被正確地判為無病的概率。

③：假陰性率：也稱真陽性率，即實際有病但根據該診斷試驗被定為非病者的概率。

④：假陽性率：即實際無病但根據該診斷試驗被定為有病的概率。

 （2）可靠性評價

①：變異系數：當做定量試驗時，可用變異系數來表示可靠性，即所測平均數的標準差與測定的均數之比。

②：符合率：指同一批研究對象兩次診斷結果均為陽性與均為陰性的人數之和占所有進行診斷試驗人數的比率。