秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)是研究動(dòng)物遺傳、個(gè)體發(fā)育和行為活動(dòng)的重要模式生物，能夠研究從分子細(xì)胞水平到整體系統(tǒng)水平的相關(guān)生命活動(dòng)的作用機(jī)理。顯微注射技術(shù)使用尖 端開口直徑為微米級(jí)的玻璃微管，將核酸注入線蟲的性腺，進(jìn)而被成熟的卵細(xì)胞吸收，以染色體外遺傳物質(zhì)的形式存在。而顯微注射技術(shù)是線蟲領(lǐng)域的核心技術(shù)，廣泛應(yīng)用于研究線蟲的基因表達(dá)、功能和基因間的相互作用等。

（圖片來源于攝影師馬克奧-西奧卡）

實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

主要儀器包括：

顯微操縱器、拉制儀、注射泵、體式顯微鏡或倒置顯微鏡等。

試劑耗材包括：

瓊脂糖、礦物油、帶芯玻璃管、載玻片、拾取針、恢復(fù)緩沖液、OP50培養(yǎng)基、加樣針等。

實(shí)驗(yàn)步驟

01、制備瓊脂糖固定板

移液槍取約50μl加熱溶解的2%瓊脂糖溶液滴在24mm×60 mm的載玻片上，用另一載玻片輕壓其上(小心氣泡產(chǎn)生)，待瓊脂糖凝固后(約5分鐘)，將上面的玻片從側(cè)面滑下即可。將制作好的瓊脂板室溫過夜或80℃干燥1小時(shí)后可疊放起來備用。

圖：瓊脂糖固定板的制備^[1]。A. 用兩條膠帶將載玻片固定在干凈的工作臺(tái)上；B. 在載玻片中間滴一滴約50μl新鮮熱熔2% 瓊脂糖溶液；C. 將顯微鏡載玻片放在瓊脂糖滴上，輕輕按下使其變平。瓊脂糖凝固并取出顯微鏡載玻片。

02、制備注射針

注射針對(duì)于注射成功與否至關(guān)重要，使用水平拉制儀通過調(diào)節(jié)速度、拉力等參數(shù)可穩(wěn)定獲得兩根相同的注射針，建議使用有芯玻璃管進(jìn)行拉制，其芯能夠使注射液迅速充滿針頭尖端，可以很好的排出氣泡。注射針的錐度一般5-7mm，尖端0.5-0.9μm。

MP-500有著前衛(wèi)智能的操作界面及加熱片限位槽等人性化設(shè)計(jì)，集安全性與人性化于一體，輕松滿足微電極相關(guān)實(shí)驗(yàn)的需求。

03、制備注射液并加入注射針

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，選擇擬注射的物質(zhì)，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)等。注射物的純度是轉(zhuǎn)入效率高低的重要影響因素之一。通過注射針的尾端，用細(xì)長的加樣針將注射液灌入，等待數(shù)分鐘，觀察針尖有無氣泡。

04、注射體積校準(zhǔn)

將注射針裝到注射泵上，吸入待注射液。在顯微鏡視野中心放一把微尺，上面放置一個(gè)裝適量礦物油的4厘米的培養(yǎng)皿。將注射針浸入礦物油中，注射一次得到一個(gè)液滴球，通過微尺測量球體直徑計(jì)算出注射的體積，調(diào)整注射液滴的大小使其符合所需的直徑。1 nL液滴的半徑為0.062 mm (V = 4/3πR3)。

瑞沃德R480玻璃微電極注射泵，注射精度高，運(yùn)行穩(wěn)定，密封性良好，保證注射過程不會(huì)出現(xiàn)漏液情況。

05、破針

將玻片放在加入注射油的瓊脂墊上，移動(dòng)微操使注射針與玻片邊緣相撞，注射針尖端被撞破，可觀察到有液泡自動(dòng)滲出，該方法更易于刺入線蟲體內(nèi)。

06、固定線蟲

一般挑選即將產(chǎn)卵或體內(nèi)有少量卵的年輕成蟲進(jìn)行注射，此時(shí)期性腺發(fā)育成熟，較易被DNA 轉(zhuǎn)染從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代。使用拾取針將線蟲挑至瓊脂糖固定墊上，調(diào)整位置使性腺暴露，滴加注射油覆蓋整個(gè)蟲體。固定操作要迅速，否則線蟲容易脫水而死。

圖：固定在固定板上并準(zhǔn)備注射的線蟲。箭頭表示在性腺中注射首 選部位。比例尺為50μm^[1]。

07、注射

將瓊脂糖固定板放在載物臺(tái)上，顯微鏡下找到線蟲，調(diào)整焦距，將性腺部位聚焦在正確的平面。使用微操，將注射針尖刺入性腺。啟動(dòng)微量注射泵進(jìn)行注射，能觀察到注射液在性腺中快速流動(dòng)，注射后的性腺被液體充滿。

圖：顯示注射物注射前(1)和注射后(2)的流動(dòng)。箭頭標(biāo)記性腺中的區(qū)域，注射物到達(dá)的位置^[2]。

MM-500電動(dòng)顯微操縱器與顯微鏡配合使用，可以完成人手不能從事的精細(xì)運(yùn)動(dòng)的顯微操作，體積小巧輕便，人性化中英文操作界面，操作起來更便捷。

08、恢復(fù)

在體視顯微鏡下，滴加恢復(fù)緩沖液至注射后的線蟲。一般等待2-5 min，線蟲活力恢復(fù)，即頭部左右搖擺，身體開始游動(dòng)，即可挑至培養(yǎng)板上，進(jìn)行20℃常規(guī)培養(yǎng)。

瑞沃德提供MP-500程控水平電極拉制儀、MM-500電動(dòng)顯微操縱器、R480玻璃微電極注射泵組合方案，可對(duì)斑馬魚、線蟲等胚胎、幼體進(jìn)行超精細(xì)顯微注射。

瑞沃德注射系統(tǒng)

注意事項(xiàng)^[2]：

a．瓊脂糖固定板：若線蟲在瓊脂糖固定板上短時(shí)間內(nèi)死亡，則說明固定板過于干燥，可換瓊脂糖層稍薄的固定墊，因?yàn)榄傊堑闹饕饔檬俏站€蟲的水分；若線蟲無法粘牢，則說明固定墊太濕或太薄，可繼續(xù)在烘箱內(nèi)放一段時(shí)間，或?qū)⒕€蟲先粘在固定墊上后加油；

b．注射物質(zhì)：注射DNA使用前要混勻并離心以避免雜質(zhì)阻塞針頭。注射DNA的總濃度一般控制在200mg/L以下，因?yàn)檩^高濃度的DNA可能產(chǎn)生毒性或過量表達(dá)，從而影響下一代的表型恢復(fù)；

c．注射角度：注射針與性腺最 好呈銳角，推薦與頭部或尾部幾乎平行或呈15℃角；

d．實(shí)驗(yàn)樣本：被注射的線蟲需要保證其食物充足，生長狀態(tài)健康；

f．注射后線蟲死亡率高：注射后等待恢復(fù)的時(shí)間過短或太長；可能是注射針尖太粗或注射DNA 被污染。針對(duì)此原因，可使用較細(xì)注射針，每次只注射一側(cè)性腺，若注射操作正確，但不產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因線蟲，則可能是轉(zhuǎn)基因致死或注射核酸污染，可重新純化。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Matthias Rieckher and Nektarios Tavernarakis. Generation of Caenorhabditis elegans Transgenic Animals by DNA Microinjection [J].Bio Protocol, 2017, 7(19): e2565.

[2] Krishna S. Ghanta et al., Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans[J].Star Protocols, 2021, 2(3): 100748.

本文圍繞芯片洗干儀的規(guī)范操作展開，核心在于通過標(biāo)準(zhǔn)化流程實(shí)現(xiàn)清洗與干燥的一致性、潔凈度與良率的穩(wěn)定。文章以可執(zhí)行的步驟和關(guān)鍵工藝參數(shù)為線索，幫助操作人員建立可追溯的作業(yè)方案，避免因誤操作導(dǎo)致污染或器件損傷。

在正式執(zhí)行前需完成前期準(zhǔn)備：檢查設(shè)備狀態(tài)、確認(rèn)腔體與管路無泄漏，校準(zhǔn)液位與溫控傳感器，核對(duì)清洗液的配比與有效期，確保工作環(huán)境符合無塵要求。

步驟一，預(yù)沖洗。以去離子水低速流動(dòng)清潔芯片表面，去除大顆粒與污染物。步驟二，清洗循環(huán)，按工藝配方投放清洗液并維持規(guī)定溫度、濃度與泵速，使表面充分潤濕并去污。步驟三，再?zèng)_洗，采用高純水完成尾沖，降低離子與殘留物。步驟四，干燥，按腔體配置選擇熱風(fēng)、真空或混合干燥，控制溫度、時(shí)間與干燥介質(zhì)，避免水滴再附著。

工藝參數(shù)與質(zhì)量控制是核心。記錄批次號(hào)、清洗溫度、時(shí)間、液位、循環(huán)模式及干燥條件，完成后進(jìn)行外觀檢查與殘留檢測，并保存參數(shù)數(shù)據(jù)以實(shí)現(xiàn)追溯與統(tǒng)計(jì)分析。

安全與維護(hù)方面，操作時(shí)佩戴防護(hù)用品，化學(xué)品存放在專用區(qū)域并確保通風(fēng)良好；定期清潔濾網(wǎng)、密封圈和閥門，傳感器需做自檢以防漂移，發(fā)現(xiàn)異常應(yīng)立即停機(jī)并報(bào)告。

通過上述規(guī)范化步驟，芯片洗干儀能夠提供穩(wěn)定的清洗與干燥效果，提升良率并降低返工風(fēng)險(xiǎn)。建議持續(xù)開展SOP培訓(xùn)、數(shù)據(jù)分析與現(xiàn)場審核，以確保工藝可重復(fù)、數(shù)據(jù)可追溯，建立以專業(yè)態(tài)度支撐的運(yùn)維體系。本公司工藝團(tuán)隊(duì)將以數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的過程控制為基礎(chǔ)，致力于提供可控、可溯、可擴(kuò)展的設(shè)備操作方案。

　　ELISA實(shí)驗(yàn)原理：ELISA的原理、類型及操作步驟

　　ELISA的原理

　　ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時(shí)，受檢標(biāo)本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。

　　ELISA方法類型和操作步驟

　　elisa可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體，②酶標(biāo)記的抗原或抗體，③酶作用的底物。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測的具備條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法。

　　(一)雙抗體夾心法

　　雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：

　　(1)將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

　　(2)加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。

　　(3)加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。

　　(4)加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。

　　根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物，即可用雙抗原夾心法測定標(biāo)本中的抗體。

　　(二)雙位點(diǎn)一步法

　　在雙抗體夾心法測定抗原時(shí)，如應(yīng)用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步。這種雙位點(diǎn)一步不但簡化了操作，縮短了反應(yīng)時(shí)間，如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測定抗原的ELISA提高到新水平。

　　在一步法測定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)(hookeffect)，類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測抗原濃度相當(dāng)高時(shí)，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

　　(三)間接法測抗體

　　間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：

　　(1)將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。

　　(2)加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中被洗去。

　　(3)加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接dibiao記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對(duì)某種疾病的抗體，可用酶標(biāo)羊抗人IgG抗體。

　　(4)加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。

　　本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體。

　　(四)競爭法

　　競爭法可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：

　　(1)將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。

　　(2)待測管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng)。如受檢標(biāo)本中無抗原，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標(biāo)本中含有抗原，則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會(huì)與固相抗體結(jié)合，競爭性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機(jī)會(huì)，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標(biāo)抗原，保溫后，酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合可達(dá)最充分的量。洗滌。

　　(3)加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原含量越多。

　　(五)捕獲法測IgM抗體

　　血清中針對(duì)某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在，后者會(huì)干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM(包括異性IgM和非特異性IgM)固定在固相上，在去除IgG后再測定特異性IgM。操作步驟如下：

　　(1)將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。

　　(2)加入稀釋的血清標(biāo)本：保溫反應(yīng)后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。

　　(3)加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合。洗滌。

　　(4)加入針對(duì)特異性的酶標(biāo)抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合。洗滌。

　　(5)加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標(biāo)本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應(yīng)。

　　(六)應(yīng)用親和素和生物素的ELISA

　　ELISA實(shí)驗(yàn)原理：ELISA的原理、類型及操作步驟!本生(天津)健康科技有限公司由具有行業(yè)背景和豐富市場經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人士組成，于為生命科學(xué)研究領(lǐng)域提供產(chǎn)品，為廣大科研工作者提供服務(wù)。 既能滿足研發(fā)類客戶對(duì)產(chǎn)品種類、包裝的特殊要求，也能滿足生產(chǎn)型企業(yè)從小試、中試到規(guī)?；a(chǎn)各個(gè)階段的綜合需求。本生!您信任的合作伙伴。我們?cè)概c您真誠合作，共創(chuàng)美好的未來。

　　實(shí)驗(yàn)室組織類樣品在進(jìn)行研磨前處理時(shí)，往往要將樣品分成少量多批次，這樣可以盡可能地滿足實(shí)驗(yàn)檢測要求，提高實(shí)驗(yàn)效率。為達(dá)到這樣的效果，我們需要用到組織研磨機(jī)。

　　組織研磨機(jī)是高通量組織研磨儀搭配研磨適配器組成的，原本搭載的兩個(gè)球磨罐，替換成了可裝載多個(gè)離心管的研磨適配器，以實(shí)現(xiàn)少量多批次研磨的目標(biāo)。下面上海凈信就來詳細(xì)介紹下組織研磨機(jī)的工作原理及操作使用步驟。

　　組織研磨機(jī)工作原理

　　組織研磨機(jī)本質(zhì)上是二維振動(dòng)球磨機(jī)，其工作區(qū)域有兩個(gè)搖臂，運(yùn)行時(shí)會(huì)做高頻次的“∞”形橫向水平擺動(dòng)，高速運(yùn)動(dòng)的搖臂會(huì)帶動(dòng)研磨罐及罐內(nèi)研磨球，賦予其動(dòng)能，研磨球?qū)悠愤M(jìn)行撞擊、擠壓和摩擦，實(shí)現(xiàn)樣品的精細(xì)研磨。

　　相比于常規(guī)型號(hào)的設(shè)備，組織研磨機(jī)用研磨適配器替換了研磨罐，從而可以裝填更多樣品。研磨適配器是類似于離心管架的容器，內(nèi)部可以放置多個(gè)離心管，離心管內(nèi)部可以放置樣品及研磨球。設(shè)備運(yùn)行時(shí)，離心管內(nèi)的研磨球?qū)悠愤M(jìn)行撞擊、摩擦和擠壓，完成樣品的精細(xì)研磨。

　　組織研磨機(jī)操作使用步驟

　　1、將簡單處理的組織樣品和適量研磨球放入離心管中，然后將裝好樣品的離心管放入研磨適配器中。

　　2、如果樣品需要低溫研磨，可先將裝有樣品的適配器放入液氮罐中冷凍降溫，幾分鐘后取出。

　　3、將冷凍后的研磨適配器放在夾具中間，調(diào)整位置后利用自動(dòng)中心定位的緊固裝置和安全鎖緊裝置進(jìn)行固定。

　　4、蓋上設(shè)備倉蓋，通過液晶觸摸屏設(shè)置振動(dòng)頻率、振動(dòng)時(shí)間。

　　5、啟動(dòng)設(shè)備，開始對(duì)樣品進(jìn)行破碎研磨，可從觀察窗觀察研磨平臺(tái)運(yùn)行情況。

　　6、等待研磨完成，打開倉蓋，取出樣品，關(guān)閉設(shè)備。

　　組織研磨機(jī)實(shí)驗(yàn)效果案例：

　　組織研磨對(duì)肺組織研磨效果圖

　　組織研磨對(duì)柑橘研磨效果圖

　　組織研磨對(duì)PCT材料研磨效果圖

　　組織研磨對(duì)多孔材料研磨效果圖

　　組織研磨對(duì)水凝膠研磨效果圖

　　組織研磨對(duì)老鼠肝組織研磨效果圖

　　以上就是對(duì)組織研磨機(jī)的工作原理和操作使用步驟的介紹，多樣品組織研磨機(jī)對(duì)于動(dòng)物、植物組織樣品研磨、生物細(xì)胞破壁、DNA/RNA提取都有良好的處理效果，應(yīng)用領(lǐng)域涵蓋農(nóng)業(yè)、食品、生物、環(huán)境等多個(gè)行業(yè)。