你知道嗎？

       從18世紀(jì)血球計(jì)數(shù)板首次被應(yīng)用于分析病人血液樣本以來，逐漸發(fā)展為實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)工具。

       但是由于其本身固有設(shè)計(jì)的簡易性和使用過程的復(fù)雜性，導(dǎo)致其計(jì)數(shù)結(jié)果會有一個必然的誤差。其誤差主要來源于人為操作因素：

細(xì)胞懸液的混勻

       均勻細(xì)胞懸液的準(zhǔn)備對計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。對于某些極易聚團(tuán)或未能均勻打散的細(xì)胞懸液，人工計(jì)數(shù)時，往往不易識別。

細(xì)胞懸液的稀釋

       依據(jù)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的習(xí)慣，通常會采取對四個頂角的大格內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)，每個大格的細(xì)胞一般落在30-50個之間時，計(jì)數(shù)結(jié)果會更加準(zhǔn)確。這就意味著，細(xì)胞懸液過濃或者是過稀都不利于獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。多數(shù)情況下，我們需要對懸液進(jìn)行有效的稀釋。

蓋玻片的擺放

       據(jù)一項(xiàng)研究表明，在計(jì)數(shù)過程中，蓋玻片的位置不準(zhǔn)確可造成7.6%的計(jì)數(shù)差異。

人工計(jì)數(shù)過程的誤差

       一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明，不同操作者之間的計(jì)數(shù)差異能高達(dá)52%，而同一個操作者的計(jì)數(shù)差異為20%。在計(jì)數(shù)過程中，往往需要同一個人在相同的條件下進(jìn)行多次計(jì)數(shù)以消除誤差。（即使這樣，也可能會產(chǎn)生20%的誤差）

人為計(jì)算過程的誤差

       通過計(jì)數(shù)板獲取的數(shù)據(jù)結(jié)果，需要通過一系列的計(jì)算，從而轉(zhuǎn)化成實(shí)際的細(xì)胞濃度數(shù)據(jù)。再乘以細(xì)胞原液的稀釋倍數(shù)（如臺盼藍(lán)的稀釋等），方能得到所需樣品的細(xì)胞濃度。計(jì)算過程中的誤差也會影響到Z終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

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上一期，我們通過了解動物恐懼記憶相關(guān)的兩種研究——穿梭實(shí)驗(yàn)與跳臺實(shí)驗(yàn)，探究了通過特定的場景刺激（強(qiáng)光、電流和聲音等）使小鼠產(chǎn)生恐懼記憶，經(jīng)過一定時間強(qiáng)化后，環(huán)境與刺激兩者被小鼠聯(lián)系在一起，當(dāng)小鼠再次回到該環(huán)境中便會出現(xiàn)恐懼相關(guān)行為的兩種實(shí)驗(yàn)流程。

本期，我們將繼續(xù)介紹兩種研究小鼠恐懼記憶的測試——避暗實(shí)驗(yàn)與巴恩斯迷宮實(shí)驗(yàn)，探究動物大腦儲存恐懼記憶的奧秘。

避暗實(shí)驗(yàn)

01.原理

利用鼠類的嗜暗習(xí)性設(shè)計(jì)，主要測試動物對明暗辨別覺的學(xué)習(xí)記憶能力。動物由于嗜暗習(xí)性而偏好進(jìn)入和停留在暗室，當(dāng)動物進(jìn)入暗室或停留暗室時則會受到電擊，動物為了避免受到電擊傷害就會尋找安全區(qū)（明室），經(jīng)幾次反復(fù)后，ZZ記住安全區(qū)域。

02.實(shí)驗(yàn)材料

03.實(shí)驗(yàn)方法

適應(yīng)期

實(shí)驗(yàn)開始前3-7天，每天抓取、輕撫動物，讓其適應(yīng)被實(shí)驗(yàn)人員抓取，避免實(shí)驗(yàn)過程中因?qū)嶒?yàn)人員抓取而造成動物處于應(yīng)激狀態(tài)，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠的問題。

建模期

① 時間：第 一天② 強(qiáng)度：

• 大鼠：電流：0.65-1.8mA（推薦0.8mA），或，電壓65-70V。

• 小鼠：電流：0.15-0.6mA（推薦0.25mA），或，電壓30-36V。

③ 頻率：5-15Hz電流。

④ 刺激方法：實(shí)驗(yàn)開始前，將動物放入暗箱，適應(yīng)5分鐘。隨后對暗箱進(jìn)行通電，持續(xù)5分鐘，此時明箱底部沒有通電。

測試期

① 時間：第二天② 方法：將動物放進(jìn)明箱，不進(jìn)行通電，記錄5分鐘。

04.數(shù)據(jù)分析

①物活動軌跡，動物第 一次進(jìn)入暗箱的時間（潛伏期），分別在兩個箱體的活動時間，活動距離。

② P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

05.注意事項(xiàng)

• 選擇體重均勻動物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測試時大鼠體重需<300g，確保體重不影響電擊效果。

• 不同品系動物本身會有區(qū)別，常規(guī)推薦使用C57BL/6J小鼠和SD大鼠。

• 實(shí)驗(yàn)前后注意清理電擊柵欄中的動物排泄物（排泄物會影響通電性及損壞電發(fā)生器）。

• 環(huán)境清理，通過酒精擦拭、晾干盡可能去除上一只動物氣味，儀器設(shè)備具有通風(fēng)性。

巴恩斯迷宮實(shí)驗(yàn)

01.原理

1979年，Barnes 建立了巴恩斯迷宮，與水迷宮和放射臂迷宮類似，它是基于嚙齒類動物天生的探索特性，應(yīng)用噪音、強(qiáng)光和暴露的開放環(huán)境作為應(yīng)激手段，促使動物尋找目標(biāo)洞。經(jīng)過訓(xùn)練，動物學(xué)習(xí)并記憶目標(biāo)箱的位置。該實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)在于對動物的應(yīng)激性刺激較小，既不像放射臂迷宮那樣需要禁食，也不像水迷宮那樣應(yīng)激性強(qiáng)。因此，在記憶研究中較為常用。尤其適用于與應(yīng)激相關(guān)的記憶研究以及基因敲除小鼠的行為表型研究。

02.實(shí)驗(yàn)材料

巴恩斯迷宮，smart3.0

03.實(shí)驗(yàn)方法

① 實(shí)驗(yàn)開始前3-7天，每天抓取、輕撫動物，讓其適應(yīng)被實(shí)驗(yàn)人員抓取，避免實(shí)驗(yàn)過程中因?qū)嶒?yàn)人員抓取而造成動物處于應(yīng)激狀態(tài)，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠的問題。

② 實(shí)驗(yàn)第1天，將動物從目標(biāo)孔洞放入目標(biāo)箱內(nèi)適應(yīng)4分鐘（只進(jìn)行這一次）。

③ 實(shí)驗(yàn)第2-7天，將動物移動至平臺中 央，用透明圓筒限制活動5秒，后撤掉圓筒開始計(jì)時，同時給與動物刺激（強(qiáng)光，聲音等）。

• 動物成功進(jìn)入目標(biāo)箱，則讓動物在目標(biāo)箱內(nèi)停留30秒。

• 若動物4分鐘內(nèi)沒有找到目標(biāo)箱，則誘導(dǎo)動物進(jìn)入目標(biāo)箱，停留30秒。

④ 隨機(jī)轉(zhuǎn)動圓盤，使孔位與上一次實(shí)驗(yàn)不同，但目標(biāo)箱的方位始終保持不變。每天重復(fù)2次上一步的實(shí)驗(yàn)流程。

04.數(shù)據(jù)分析

① 第 一次探究洞的潛伏期，到達(dá)目標(biāo)洞的時間，每只動物的錯誤次數(shù)（探究一個錯誤的洞即視為錯誤一次）。

• 潛伏期僅做參考，潛伏期越短，說明動物學(xué)會了迷宮原理，記憶水平越好。

• 到達(dá)目標(biāo)洞的時間越短，說明動物記憶水平越好。

• 動物錯誤次數(shù)越多，說明動物學(xué)會了迷宮原理，但沒有記住目標(biāo)箱的位置。

② 采用單因素方差分析（one way-ANOVA），當(dāng)多組間有差異時，兩兩比較采用Fisher's LSD post hoc多重比較方法。

③P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

05.注意事項(xiàng)

• 每只動物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)進(jìn)行環(huán)境清理，盡可能去除上一只動物的氣味。

• 不同品系動物對此實(shí)驗(yàn)的偏好性有很大不同，建議使用C57BL/6J小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

【參考文獻(xiàn)】

Rosenfeld Cheryl S,Ferguson Sherry A,Barnes maze testing strategies with small and large rodent models.[J] .J Vis Exp, 2014, undefined: e51194.

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文獻(xiàn)精讀第36期

記憶印跡是學(xué)習(xí)或經(jīng)驗(yàn)相關(guān)記憶產(chǎn)生的關(guān)鍵，聯(lián)想恐懼記憶的形成主要?dú)w因于谷氨酸能投射神經(jīng)元（Projection Neurons, PNs），這些神經(jīng)元具備經(jīng)驗(yàn)依賴的可塑性。然而，GABA能中間神經(jīng)元（Interneurons, INs）也會對記憶相關(guān)的線索做出反應(yīng)，并廣泛地調(diào)節(jié)PNs的功能。但是，學(xué)習(xí)是否需要特定的INs選擇性地參與記憶編碼仍然是一個懸而未決的問題。

2022年8月1日，美國西奈山伊坎醫(yī)學(xué)院和阿拉巴馬大學(xué)伯明翰醫(yī)學(xué)院的研究人員在《Neuron》期刊上發(fā)表題為“Control of fear by discrete prefrontal GABAergic populations encoding valence-speci?c information”的文章。該文章證實(shí)，積極和消極的體驗(yàn)?zāi)軌蚣せ钋邦~葉生長抑素中間神經(jīng)元（Somatostatin Interneurons, SST-INs）的離散群體，這些不同的SST-INs離散群體能夠?qū)謶钟洃浶纬上喾吹目刂?。研究的結(jié)果強(qiáng)調(diào)了INs在情緒學(xué)習(xí)中的重要作用。

小清蛋白中間神經(jīng)元（Parvalbumin Interneurons, PV-INs）、血管活性腸肽中間神經(jīng)元（Vasoactive Intestinal Peptide Interneurons, VIP-INs）以及SST-INs在記憶獲取和鞏固的環(huán)路動態(tài)編碼過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。該文章作者最近的研究（Cummings and Clem, Nat. Neurosci., 2020）證明了邊緣前皮層（Prelimbic Cortex, PL）中的SST-INs在聽覺恐懼條件訓(xùn)練后表現(xiàn)出突觸效能增強(qiáng)以及線索誘發(fā)的活動，這表明它們參與了記憶形成。作者進(jìn)一步證明，SST-INs通過激活大腦中的網(wǎng)絡(luò)來控制動物防御性的僵直行為，而這一效果可能是通過緩解PV-INs介導(dǎo)的抑 制來協(xié)調(diào)的。

在該研究中，作者使用基因標(biāo)記的方法，探討了SST-INs作為離散細(xì)胞群的一部分是否在記憶編碼中起作用。在小鼠條件恐懼實(shí)驗(yàn)中，學(xué)習(xí)過程主要激活PL中的SST-INs，而非PV-INs和VIP-INs。隨后，作者進(jìn)一步證明，這些被激活的SST-INs在記憶提取過程中優(yōu)先被再次激活。并且，作者通過結(jié)合光遺傳學(xué)的手段證實(shí)，這些SST-INs控制著恐懼線索誘導(dǎo)的小鼠僵直行為。此外，作者還通過電生理實(shí)驗(yàn)證實(shí)，恐懼學(xué)習(xí)激活的SST-INs表現(xiàn)出獨(dú)特的輸入和輸出突觸傳遞特性。這些結(jié)果表明，PL中的SST-INs在恐懼記憶編碼中起著關(guān)鍵作用。

綜上所述，條件恐懼記憶依賴于PL中解剖上和功能上離散的SST-INs群體，但是受到獎賞相關(guān)的SST-INs的正交網(wǎng)絡(luò)的相反控制。該研究為記憶編碼中細(xì)胞特異性的GABA能微環(huán)路提供了重要見解，并概述了在行為可塑性過程中INs可能變得功能特異化的突觸機(jī)制。

研究方法亮點(diǎn)

這項(xiàng)工作闡述了PL中不同的SST-INs離散群體在恐懼記憶表達(dá)中的作用。該研究用到了腦立體定位注射、光遺傳學(xué)、電生理記錄、行為學(xué)評估以及免疫組化等實(shí)驗(yàn)技術(shù)。瑞沃德深耕生命科學(xué)研究領(lǐng)域20年，一直致力于為客戶提供可信賴的解決方案和服務(wù)。瑞沃德可提供該研究所涉及的腦立體定位注射、光遺傳學(xué)、電生理記錄、行為學(xué)評估以及免疫組化的完整解決方案。截至目前，瑞沃德產(chǎn)品及服務(wù)覆蓋海內(nèi)外100多個國家和地區(qū)，客戶涵蓋全/球700+醫(yī)院，1000+科研院所，6000+高等院校，已助力全/球科研人員發(fā)表SCI文章14500+，獲得行業(yè)廣泛認(rèn)可。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.neuron.2022.07.004