上一期，我們通過了解動物恐懼記憶相關的兩種研究——穿梭實驗與跳臺實驗，探究了通過特定的場景刺激（強光、電流和聲音等）使小鼠產(chǎn)生恐懼記憶，經(jīng)過一定時間強化后，環(huán)境與刺激兩者被小鼠聯(lián)系在一起，當小鼠再次回到該環(huán)境中便會出現(xiàn)恐懼相關行為的兩種實驗流程。

本期，我們將繼續(xù)介紹兩種研究小鼠恐懼記憶的測試——避暗實驗與巴恩斯迷宮實驗，探究動物大腦儲存恐懼記憶的奧秘。

避暗實驗

01.原理

利用鼠類的嗜暗習性設計，主要測試動物對明暗辨別覺的學習記憶能力。動物由于嗜暗習性而偏好進入和停留在暗室，當動物進入暗室或停留暗室時則會受到電擊，動物為了避免受到電擊傷害就會尋找安全區(qū)（明室），經(jīng)幾次反復后，ZZ記住安全區(qū)域。

02.實驗材料

03.實驗方法

適應期

實驗開始前3-7天，每天抓取、輕撫動物，讓其適應被實驗人員抓取，避免實驗過程中因?qū)嶒炄藛T抓取而造成動物處于應激狀態(tài)，造成實驗結果不可靠的問題。

建模期

① 時間：第 一天② 強度：

• 大鼠：電流：0.65-1.8mA（推薦0.8mA），或，電壓65-70V。

• 小鼠：電流：0.15-0.6mA（推薦0.25mA），或，電壓30-36V。

③ 頻率：5-15Hz電流。

④ 刺激方法：實驗開始前，將動物放入暗箱，適應5分鐘。隨后對暗箱進行通電，持續(xù)5分鐘，此時明箱底部沒有通電。

測試期

① 時間：第二天② 方法：將動物放進明箱，不進行通電，記錄5分鐘。

04.數(shù)據(jù)分析

①物活動軌跡，動物第 一次進入暗箱的時間（潛伏期），分別在兩個箱體的活動時間，活動距離。

② P<0.05認為具有統(tǒng)計學顯著性差異。

05.注意事項

• 選擇體重均勻動物進行實驗，測試時大鼠體重需<300g，確保體重不影響電擊效果。

• 不同品系動物本身會有區(qū)別，常規(guī)推薦使用C57BL/6J小鼠和SD大鼠。

• 實驗前后注意清理電擊柵欄中的動物排泄物（排泄物會影響通電性及損壞電發(fā)生器）。

• 環(huán)境清理，通過酒精擦拭、晾干盡可能去除上一只動物氣味，儀器設備具有通風性。

巴恩斯迷宮實驗

01.原理

1979年，Barnes 建立了巴恩斯迷宮，與水迷宮和放射臂迷宮類似，它是基于嚙齒類動物天生的探索特性，應用噪音、強光和暴露的開放環(huán)境作為應激手段，促使動物尋找目標洞。經(jīng)過訓練，動物學習并記憶目標箱的位置。該實驗的優(yōu)點在于對動物的應激性刺激較小，既不像放射臂迷宮那樣需要禁食，也不像水迷宮那樣應激性強。因此，在記憶研究中較為常用。尤其適用于與應激相關的記憶研究以及基因敲除小鼠的行為表型研究。

02.實驗材料

巴恩斯迷宮，smart3.0

03.實驗方法

① 實驗開始前3-7天，每天抓取、輕撫動物，讓其適應被實驗人員抓取，避免實驗過程中因?qū)嶒炄藛T抓取而造成動物處于應激狀態(tài)，造成實驗結果不可靠的問題。

② 實驗第1天，將動物從目標孔洞放入目標箱內(nèi)適應4分鐘（只進行這一次）。

③ 實驗第2-7天，將動物移動至平臺中 央，用透明圓筒限制活動5秒，后撤掉圓筒開始計時，同時給與動物刺激（強光，聲音等）。

• 動物成功進入目標箱，則讓動物在目標箱內(nèi)停留30秒。

• 若動物4分鐘內(nèi)沒有找到目標箱，則誘導動物進入目標箱，停留30秒。

④ 隨機轉(zhuǎn)動圓盤，使孔位與上一次實驗不同，但目標箱的方位始終保持不變。每天重復2次上一步的實驗流程。

04.數(shù)據(jù)分析

① 第 一次探究洞的潛伏期，到達目標洞的時間，每只動物的錯誤次數(shù)（探究一個錯誤的洞即視為錯誤一次）。

• 潛伏期僅做參考，潛伏期越短，說明動物學會了迷宮原理，記憶水平越好。

• 到達目標洞的時間越短，說明動物記憶水平越好。

• 動物錯誤次數(shù)越多，說明動物學會了迷宮原理，但沒有記住目標箱的位置。

② 采用單因素方差分析（one way-ANOVA），當多組間有差異時，兩兩比較采用Fisher's LSD post hoc多重比較方法。

③P<0.05認為具有統(tǒng)計學顯著性差異。

05.注意事項

• 每只動物實驗結束后應進行環(huán)境清理，盡可能去除上一只動物的氣味。

• 不同品系動物對此實驗的偏好性有很大不同，建議使用C57BL/6J小鼠進行實驗。

【參考文獻】

Rosenfeld Cheryl S,Ferguson Sherry A,Barnes maze testing strategies with small and large rodent models.[J] .J Vis Exp, 2014, undefined: e51194.

jove.com/...

背景

1930年，Tolman 和 Honzik 應用14個單元Ｔ型迷宮，研究大鼠的潛伏學習（Latent Learning）。隨著研究深入，多單元迷宮演變?yōu)槟壳皯玫模悦詫m。1939年，Dennis首次定義了大鼠在Ｔ迷宮中的自發(fā)交替（Spontaneous Alternation）行為，認為大鼠能夠?qū)μ剿鬟^的臂產(chǎn)生內(nèi)起YZ（Internal Inhibition），而進入沒有探索過的臂，從而增加發(fā)現(xiàn)食物的機會。

原理

T/Y迷宮是一種評價空間記憶能力的行為實驗方法，主要應用于動物的辨別性學習、工作記憶和參考記憶的測試。在本實驗中，工作記憶主要指短期記憶，而參考記憶主要指長期記憶。工作記憶能力下降，可出現(xiàn)空間定位困難等癥狀，參考記憶能力下降可出現(xiàn)新知識學習能力下降等癥狀。實驗過程中，動物對目標臂的選擇基于動物記住上次探索過的目標臂，以及對整體實驗流程的熟悉程度；可以通過不同的實驗方法來測試動物工作記憶和參考記憶的完整情況。

實驗材料

T迷宮、Y迷宮、Smart 3.0

實驗方法

01.自發(fā)連續(xù)交替選擇實驗

此實驗為運用T/Y迷宮進行的最簡單最基礎的行為學測試，主要用于研究動物空間工作記憶的完整程度。優(yōu)點是實驗周期短，僅一天即可完成全部實驗。

• 時間

每次實驗時間不高于2分鐘，每只動物試驗連續(xù)重復10次。

• 適應期

實驗開始前（自己繁育小鼠 Handle 3天，外購動物 Handle 7天），每天抓取、輕撫動物，讓其熟悉實驗人員手，在實驗過程中不會處于應激狀態(tài)。

• 方法

關閉主臂門閘，將動物放在主臂10秒，打開主臂門閘開始計時，待動物四肢全部進入一個目標臂后，結束計時， 將動物放回主臂，關閉主臂門閘，進行下一輪實驗；2分鐘內(nèi)沒有進入任何臂，記錄實驗失敗，進行取出放回操作，進行下一輪實驗。

• 記錄數(shù)據(jù)

（1）進入左右臂的潛伏期（從主臂進入左右臂所需的時間），每次進入的臂；

（2）潛伏期主要用于判斷動物對此實驗的積極性；

（3）動物連續(xù)進入不同臂N次（N≥3），記為N-2次成功；

（4）實際成功次數(shù)/ZD成功次數(shù) 計算出動物實驗成功率，以此判斷動物自發(fā)連續(xù)交替選擇的程度 百分比越高，說明動物工作記憶能力越強。

• 注意事項

（1）此實驗為連續(xù)實驗，應完成一只動物試驗后再開展另一只動物的實驗；

（2）每只動物實驗結束后應進行環(huán)境清理，盡可能去除上一只動物的氣味；

（3）每只動物測量以及清理時間合計約25分鐘，如需對動物進行給藥，需要逐只給藥，確保藥物生效后再進行實驗。

02.獎賞交替選擇實驗（主要運用于T迷宮）

此實驗為運用T迷宮進行的較為常規(guī)的行為學測試，采用食物獎賞誘導動物完成相關行為，讓動物逐漸學會實驗規(guī)定的迷宮探索方式。主要用于研究動物參考記憶的完整程度。優(yōu)點在于利用食物形成獎賞機制，動物會更配合完成整個實驗。

適應訓練

• 時間

實驗第 一天和第二天，每日4次，每次間隔大于10分鐘。

• 方法

將多只動物放入迷宮3分鐘，讓動物進行自行探索。

• 注意事項

實驗前動物需要限食，動物體重降低至實驗前85%-90%后方可進行實驗，若動物表現(xiàn)出不喜好探索的現(xiàn)象，可以利用少量食物誘導探索。

強迫選擇訓練

• 時間

實驗第三至六天，每日6次。

• 方法

將動物放入主臂，同時在左右臂隨機一臂中放入少量食丸（如4粒），關閉另一臂的進入通道，使動物被迫完成攝食強化。

• 記錄數(shù)據(jù)

主臂滯留時間。

• 注意事項

（1）每只動物每次實驗應間隔大于10分鐘；

（2）每只動物實驗結束后應進行環(huán)境清理，盡可能去除上一只動物的氣味；

（3）訓練左臂與右臂獲得食丸數(shù)量，次數(shù)應保持一致。

測試

• 時間

實驗第七天開始，至對照組動物平均正確率達到85%結束。每天重復6次。

• 方法

（1）強迫動物從主壁進入一側(cè)實驗臂，獲得更少量的食丸獎勵（如2粒）；

（2）獲得食丸后立即將動物移回主臂（總時間應小于5秒），限制活動10秒；

（3）同時開放兩側(cè)實驗臂，動物將四肢移動進一個實驗臂視為一次選擇，結束一次實驗：

① 若進入DY步進入過的臂，則無獎勵，限制活動10s，記錄一次錯誤選擇，

② 若進入DY步未進入過的臂，則給與少量獎勵，記錄一次正確選擇。

• 記錄數(shù)據(jù)

正確選擇，錯誤選擇次數(shù)，主臂滯留時間：

（1）主壁滯留時間主要用于判斷動物對此實驗的積極性；

（2）根據(jù)正確選擇，錯誤選擇次數(shù)計算出每天的平均正確率；

（3）平均正確率提升越快，說明動物參考記憶能力越強。

• 注意事項

（1）每只動物每次實驗應間隔大于10分鐘；

（2）每只動物實驗結束后應進行環(huán)境清理，盡可能去除上一只動物的氣味；

（3）如需對動物進行給藥，則僅在此測試階段進行給藥。

03.空間識別（主要運用于Y迷宮）

此實驗為運用Y迷宮進行的較為常規(guī)的行為學測試，是根據(jù)嚙齒類動物天生對未知事物有強烈的好奇心以及探索欲望的原理進行的。優(yōu)點在于可以同時對動物的參考記憶和工作記憶進行研究，實驗方式簡單。

• 時間

（1）測試工作記憶，探索期與測試期建議間隔2小時；

（2）測試參考記憶，探索期可設置1-2天，隔天進行測試；

（3）同時測試參考與工作記憶，探索期與測試期間隔2小時，每天重復一次實驗，持續(xù)進行5-7天。

• 方法

（1）適應期：實驗開始前3-7天，每天抓取、輕撫動物，讓其適應被抓出的環(huán)境；

（2）探索期：將迷宮的一個臂封鎖，在一個臂遠離中間的位置放置動物，讓動物在其它兩個臂自由探索3分鐘；

（3）測試期：將迷宮封鎖的臂打開，在與探索期相同的位置放置動物，在讓動物自由活動3分鐘。

• 數(shù)據(jù)記錄

（1）總活動路程，未開放臂進入潛伏期，每個臂滯留時間及路程，進入每個臂的次數(shù)；

（2）總活動路程僅作為參考，排除一些無運動意愿動物的數(shù)據(jù)；

（3）潛伏期越短，說明動物記憶力越好；

（4）進入未開放臂的時間越久，運動路程越長，進入次數(shù)越多說明動物記憶力越強；

（5）同時測試參考與工作記憶時，每次試驗中放置動物的位置應保持一致，記錄動物在測試期進入另外兩個臂的時間比例。正常動物實驗初期進入未開放臂的時間比例可達到80%，隨著實驗時間的增加，比例逐漸降低至50%左右。工作記憶受損的動物在實驗開始時進入未開放臂的時間比例就接近50%左右；參考記憶受損的動物進入未開放臂的時間比例則會一直維持在一個較高的水平。

• 注意事項

（1）每只動物實驗結束后應進行環(huán)境清理，盡可能去除上一只動物的氣味；

（2）如需對動物進行給藥，則需要在探索期就進行給藥。

04.數(shù)據(jù)分析

常規(guī)方法是采用單因素方差分析（one way-ANOVA）；當多組間有差異時，兩兩比較采用Fisher's LSD post hoc多重比較方法，P<0.05認為具有統(tǒng)計學顯著性差異。

【參考文獻】

1. Deacon Robert M J, Rawlins J Nicholas P, T-maze alternation in the rodent.[J]. Nat Protoc,2006 , 1 : 7 - 12. （IF：13.493）（自發(fā)交替和獎賞交替）

2.Hughes Robert N,The value of spontaneous alternation behavior (SAB) as a test of retention in pharmacological investigations of memory.[J] .Neurosci Biobehav Rev, 2004, 28: 497-505. （IF：8.33）（自發(fā)交替與空間識別）