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  longwub 2009-10-30 00:00:00

  恩。。上面說的對，跑高濃度膠 這個問題的歸類挺好玩的。。。 你的Tm差好像太高了。。。我總是會避免有這么大的差值的。萬不得已會用touch-down PCR

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  一龍?zhí)?/a> 2009-10-26 00:00:00

  這個沒有什么特別的吧，定量PCR一般擴增的長度也和你差不多。所以不存在小片段難擴增的問題。 要注意的東西和普通的PCR沒有區(qū)別，主要是由于片段這么短，可能跑出來的電泳條帶會容易和引物二聚體的位置比較接近，要注意和引物二聚體區(qū)分開來。 把體系檢測一次，首先除了引物，和模板之外的其他反應溶液檢測一遍，如果沒問題，想想模板有沒有問題？再沒問題就看看你的引物設計有沒有問題了。

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  穩(wěn)穩(wěn)雯雯98 2009-10-30 00:00:00

  138KB還是138bp？你這個先弄清楚。 擴不出來主要是你引物的問題吧。和擴增程序沒多大關系。 你變性30s、退火20s，延伸45s就行。 —————————————————————————————— 你這兩個引物Tm差異比較大。不過我想在55~57℃退火，用我上面給你的程序應該是能夠成功的。一般的real-time PCR的擴增產(chǎn)物也就150bp左右。如果低于55℃還是P不出來，那估計就是你的引物有問題或者模板降解了。

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  asd704616717a 2009-10-30 00:00:00

  你的引物設計得不是很好，2個Tm值不協(xié)調。 但是已經(jīng)這樣了，我建議你優(yōu)化退火溫度： 先設計53、55、57、59（或60）4組，之后如果有跡象，在那個出來條帶的溫度附近再細化一下，再次優(yōu)化溫度，比如，如果你在55度出來帶了，再設計54、55、56試試看，也許就會很好了。 好運！

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