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  櫻風(fēng)旋律 2016-11-28 11:13:44

  測(cè)定酶活性ZX組成和結(jié)構(gòu)是研究酶催化作用的重要課題。目前常用方法有：化學(xué)修飾法、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)法、X－射線衍射法等。 1.化學(xué)修飾法：此方法是研究Z早，應(yīng)用Z廣泛的方法。原則上講，酶分子側(cè)鏈上的各種基團(tuán)，如羧基、羥基、巰基和咪唑基等均可由特定的化學(xué)試劑進(jìn)行共價(jià)修飾。當(dāng)它被某一化學(xué)試劑修飾后，若酶活性顯著下降或喪失，則可初步推斷該基團(tuán)為酶的必需基團(tuán)。 2.動(dòng)力學(xué)分析法：酶蛋白是含有許多解離基團(tuán)的兩性電解質(zhì)，pH改變必然影響到解離基團(tuán)的解離狀態(tài)，處于活性ZX基團(tuán)的解離狀態(tài)的改變必然影響到酶的活性。因此，通過研究酶活性與pH關(guān)系，可以推測(cè)到與催化直接相關(guān)的某些基團(tuán)的pK值，進(jìn)而推測(cè)這些基團(tuán)的作用。另外，改變反應(yīng)溫度求出Vmax和Km與pH關(guān)系，從而求出有關(guān)基因解離的DH，DH的求得有助于補(bǔ)充pK值對(duì)活性ZX的判斷。在有機(jī)溶劑存在條件下，測(cè)定酶pK值與介電常數(shù)的關(guān)系，也有助于對(duì)活性部位的判斷。 3.X－射線衍射分析法：化學(xué)修飾法和動(dòng)力學(xué)分析只能推斷酶活性部位氨基酸殘基的數(shù)目，活性ZX空間結(jié)構(gòu)的信息，則需用X－射線衍射法。采用X射線衍射法在研究酶活性ZX空間構(gòu)象時(shí)，通常是將酶與底物類似物或?qū)Ｒ恍訷Z劑形成復(fù)合物，而后作X－射線衍射分析，從而得到有關(guān)酶活性ZX構(gòu)象、酶與底物的接觸狀況以及催化機(jī)理的信息。 4.蛋白質(zhì)工程：蛋白質(zhì)工程是近年來發(fā)展的研究酶必需基團(tuán)和活性ZX的Z先進(jìn)的方法。蛋白質(zhì)工程實(shí)質(zhì)是按照人們的設(shè)想，通過改變基因來改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，制造新的蛋白質(zhì)。利用基因定點(diǎn)突變技術(shù)將酶相應(yīng)的互補(bǔ)DNA（cDNA）基因定點(diǎn)突變，突變的cDNA表達(dá)出被一個(gè)或幾個(gè)氨基酸置換的酶蛋白，再測(cè)定其活性就可以知道被置換的氨基酸是否為酶活性所必需。此方法可改變酶蛋白中任一氨基酸而不影響其他同類殘基和不引起底物和活性ZX結(jié)合的立體障礙，以及可人工地造成一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的缺失或插入，了解肽鏈的縮短或延長(zhǎng)對(duì)酶活性的影響和定點(diǎn)改變酶蛋白的糖基化位點(diǎn)或磷酸化位點(diǎn)，從而了解糖基化或磷酸化對(duì)酶結(jié)構(gòu)和功能的影響。   

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