為去除細(xì)胞沉淀中的紅細(xì)胞，在冰盒中加入2 mL紅細(xì)胞裂解液（40401ES）裂解5分鐘，然后以600 g離心，PBS重懸沉淀，用臺(tái)盼藍(lán)（40724ES）計(jì)數(shù)，再以600 g離心5 min，保留細(xì)胞沉淀立即培養(yǎng)。

將切下來(lái)的組織塊放于20 mL四抗（青/鏈霉素（60162ES）+兩性霉素B（60238ES）+慶大霉素（54076ES））運(yùn)輸液中保存過(guò)夜。

將樣本至于15 mL離心管（83506ES）中，并加入5 mL含四抗的PBS（60158ES）沖洗2-3次，至PBS稍微變得干凈透亮，再轉(zhuǎn)入無(wú)菌培養(yǎng)皿中。

用無(wú)菌手術(shù)剪在含3 mL四抗PBS的無(wú)菌培養(yǎng)皿中將組織塊剪碎，去除組織中血液、脂肪、絨毛等雜質(zhì)，剪成可以過(guò)剪槍頭大小，將剪碎的組織塊轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入3 mL含四抗的PBS，600 g離心5 min，并更換含四抗的PBS反復(fù)離心沖洗2-3次。

向離心管中加入組織塊兩倍體積消化液（41423ES），在37℃條件下，160 rpm搖床30 min。

過(guò)細(xì)胞篩（84702ES），加入10 mL含四抗的PBS沖洗，600 g離心5 min，獲得細(xì)胞沉淀。

提前準(zhǔn)備好基質(zhì)膠（Ceturegel）（40192ES）、預(yù)冷的200 μL槍頭（83050ES）及24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（84013ES）（恒溫培養(yǎng)箱預(yù)熱）。

根據(jù)細(xì)胞沉淀的量加入適量完全培養(yǎng)基，與基質(zhì)膠混合，此過(guò)程在冰上操作，輕輕吹打至充分混勻（避免在吹打過(guò)程中產(chǎn)生大量氣泡，以免影響后續(xù)種板）。

將混合液接種于預(yù)熱的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種50 μL，倒置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中，使類器官培養(yǎng)物保持半球形狀。

1h后向每孔輕輕加入500 μL事先配置好的完全培養(yǎng)基，37℃置于含5% CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)。

定期觀察類器官生長(zhǎng)情況，檢查類器官是否有污染，通過(guò)觀察類器官生長(zhǎng)速度、形態(tài)及培養(yǎng)基狀況，適時(shí)更換培養(yǎng)基或進(jìn)行傳代。

當(dāng)觀察到類器官長(zhǎng)勢(shì)迅速、生長(zhǎng)過(guò)于密集或囊泡結(jié)構(gòu)邊緣變黑時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行傳代及凍存。

棄去原培養(yǎng)基，加200 mL Dispase（40104ES）溶解基質(zhì)膠，放入培養(yǎng)箱消化1h。

加入200 mL DMEM/F12（41420ES）培養(yǎng)基終止消化，吹洗分離基質(zhì)膠，之后轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，以600 g離心5 min，保留細(xì)胞沉淀。

加入1 mL PerfCell Tryzyme? Express（40135ES）消化分離類器官，吹打2 min，加入1 mL DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，以600 g離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行接種培養(yǎng)。

按照傳代過(guò)程獲得細(xì)胞沉淀后，加入細(xì)胞沉淀三倍體積的細(xì)胞凍存液，吹打混勻細(xì)胞沉淀，保證每個(gè)凍存管（84105ES）有相同數(shù)量的細(xì)胞，以便后續(xù)復(fù)蘇。

將凍存管置于程序降溫盒中，在-80℃冰箱放置24h后，再轉(zhuǎn)移至液氮進(jìn)行長(zhǎng)期保存。

將類器官轉(zhuǎn)移至含5 mL DMEM/F12培養(yǎng)基的離心管中，輕輕混勻，以600 g離心5 min，收集細(xì)胞沉淀。

準(zhǔn)備15 mL離心管，加入5 mL DMEM/F12培養(yǎng)基;

從液氮中取一管凍存的類器官，立即放入37℃水浴鍋中不斷搖晃解凍，融化至略有冰碴時(shí)取出。