01

高甘露糖型糖鏈主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)完成初步加工，進(jìn)入高爾基體后，若甘露糖苷轉(zhuǎn)移酶對前體寡糖的修剪受阻或N-乙酰基葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶I （GnTI）活性異常，則無法進(jìn)一步修飾為復(fù)雜糖型，導(dǎo)致HM殘留（圖1）。

行業(yè)一般將甘露糖型Man5控制在≤10%，通常控制≤5%（依產(chǎn)品特性調(diào)整），Biosimilar需與原研品HM含量偏差≤±1.5%。

圖1：N-糖基化修飾途徑

02

細(xì)胞株工程改造過表達(dá)GnTI基因或者克隆篩選階段選擇蛋白表達(dá)量高且GnTI活性較高（即Man5水平低）的細(xì)胞株。

如文獻(xiàn)Scientific Reports，2024表明GnTI活性與HM水平呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)GnTI基因被敲除時（如CHO-gmt4細(xì)胞），細(xì)胞主要產(chǎn)生高甘露糖型鏈Man5（Man5GlcNAc2），如圖2所示。

這是因?yàn)镚nTI負(fù)責(zé)將N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）添加到核心糖鏈的α-1,3-連接的甘露糖上，從而啟動從高甘露糖型向復(fù)雜型糖鏈的轉(zhuǎn)化。當(dāng)GnTI缺失時，這一轉(zhuǎn)化過程受阻，導(dǎo)致高甘露糖型糖鏈在細(xì)胞中積累。

圖2：CHO-K1和CHO-gmt4（GnTI KO）細(xì)胞株在曲妥珠單抗上的Man5水平對比

IPC/IFB模式：改變細(xì)胞培養(yǎng)模式，例如選用IPC（Intensified Perfusion Culture）或IFB（Intensified Fed Batch）工藝，通過高換液率維持營養(yǎng)穩(wěn)態(tài)，減少代謝副產(chǎn)物（如NH4⁺）積累，有效降低HM水平。

上海智享生物專利案例（CN116590371B）：本案例采用濃縮補(bǔ)料灌流培養(yǎng)工藝，并通過降低pH和排出細(xì)胞代謝副產(chǎn)物乳酸和NH4⁺，有利于高爾基體對抗體的翻譯后修飾，從而降低抗體的高甘露糖基化。

進(jìn)一步添加糖型調(diào)節(jié)劑N-乙酰葡萄糖胺、Mn²⁺、尿嘧啶、半乳糖，能夠有效促進(jìn)高甘露糖型抗體的進(jìn)一步修飾，合成更加完善的雙天線糖型結(jié)構(gòu)。

P-5結(jié)果中Man5的含量從FB-1的18.9%降低至4.4%，滿足了抗體藥物生產(chǎn)中Man5含量低于5%的要求，詳細(xì)數(shù)據(jù)示例如下表1。FB代表Fed-batch補(bǔ)料批培養(yǎng)工藝，P代表濃縮補(bǔ)料灌流培養(yǎng)工藝。

表1：專利CN116590371B降低Man5的方案匯總

pH：低pH環(huán)境（如控制pH在6.7-6.8范圍內(nèi)），可增強(qiáng)高爾基體糖基轉(zhuǎn)移酶活性，促進(jìn)HM向復(fù)雜型糖鏈轉(zhuǎn)化。

降溫：在培養(yǎng)后期降溫至31°C ± 0.5°C，可延緩細(xì)胞代謝副產(chǎn)物（如NH4?）積累，減少對糖基化酶的抑制。

培養(yǎng)周期：優(yōu)化補(bǔ)料策略（如濃縮補(bǔ)料工藝）將周期縮短至10-12天，降低滲透壓和NH4?濃度，減少對GnTI活性的抑制。

滲透壓：高滲透壓（> 400 mOsm/kg）會抑制N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶（GnTI）活性，導(dǎo)致甘露糖殘基無法被進(jìn)一步加工為復(fù)雜型糖鏈。

圖3：Cell line A在各種基礎(chǔ)滲透壓（300、330、360和400 mOsm）和補(bǔ)料滲透壓（750和1250 mOsm）組合下Titer和Man5的水平

上海藥明生物專利案例（CN116121170A）: 該專利是一種通過向培養(yǎng)基中添加 N-乙?；?D-甘露糖胺（ManNAc）來降低哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)所產(chǎn)糖蛋白中高甘露糖型糖基化水平的方法。

該方法包括在傳代培養(yǎng)基或生產(chǎn)培養(yǎng)基中添加ManNAc，添加濃度20-100 mM, Man5水平可降低44%-65%，而且對蛋白產(chǎn)量、細(xì)胞生長代謝、蛋白純度、酸堿峰等其他質(zhì)量指標(biāo)均無明顯負(fù)面影響，作用機(jī)制可能是因?yàn)镸anNAc其作為N?乙酰神經(jīng)氨酸/唾液酸(Neu5Ac)的前體，添加后，促進(jìn)糖型往成熟方向合成，從而降低了Man5水平，詳細(xì)數(shù)據(jù)示例，如下表2。

表2：專利CN116121170A降低Man5的方案匯總

圖4：搖瓶中添加MnCl2對Man5的影響

03

在實(shí)際的調(diào)控策略中，常通過培養(yǎng)基篩選和成分優(yōu)化（如不同濃度UGM+GlacNAc的摸索），進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件（如溫度，滲透壓等工藝參數(shù)），達(dá)到控制HM的目的。

常見的降低HM的參數(shù)、作用機(jī)制及推薦范圍如下表3。

表3：HM的參數(shù)、作用機(jī)制及推薦范圍