概述

RNA分子的亞細胞定位和動態(tài)變化與多種生命活動密切相關(guān)。然而，在活細胞中同時追蹤多個RNA分子仍面臨技術(shù)挑戰(zhàn)。近日，加州大學爾灣分校的 Jennifer A. Prescher 和 Andrej Lupták 教授團隊在《美國化學會志》（JACS）發(fā)表研究，報道了一套基于生物發(fā)光的“RNA燈籠”系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用正交的RNA結(jié)合蛋白和分裂螢光素酶技術(shù)，實現(xiàn)了多靶點 RNA 的高分辨率成像，為RNA生物學研究提供了新的工具。

一、研究背景

傳統(tǒng)RNA成像的主流技術(shù)熒光成像，因依賴外部激發(fā)光，易造成細胞光毒性、熒光分子光漂白，且所需大尺寸適配子標簽會干擾RNA正常功能；而原位雜交技術(shù)僅能檢測固定細胞，只能獲取RNA分布靜態(tài)信息，無法捕捉其動態(tài)變化過程。

生物發(fā)光成像通過熒光素酶催化熒光素的氧化反應(yīng)產(chǎn)生光，無需任何外部激發(fā)光，從根源上避免了光毒性和光漂白；同時，生物發(fā)光的背景噪聲極低，幾乎沒有細胞自發(fā)發(fā)光的干擾，信噪比遠高于熒光成像。它兼顧了活細胞連續(xù)成像、多靶點同時檢測和無干擾低背景的要求。

該研究將此前開發(fā)出來的第一代 RNA lanterns 生物發(fā)光探針升級為多靶點、多色的正交化、模塊化生物發(fā)光成像平臺，實現(xiàn)了活細胞中多個 RNA 靶點的特異性檢測和同時動態(tài)分析。

二、核心設(shè)計：三組正交化探針構(gòu)建多色生物發(fā)光成像系統(tǒng)

研究人員基于分裂型NanoLuc螢光素酶（NanoBiT）構(gòu)建了“RNA燈籠”系統(tǒng)。該系統(tǒng)將螢光素酶分為兩個無活性的片段：LgBiT和SmBiT。只有當兩個片段在空間上靠近時，才能重新組裝為有活性的全酶并產(chǎn)生生物發(fā)光。

為實現(xiàn)RNA特異性成像，研究團隊將SmBiT與MS2外殼蛋白（MCP）融合，將LgBiT與其他RNA結(jié)合蛋白融合。同時，在目標RNA上引入結(jié)構(gòu)化的RNA標簽，該標簽包含MS2適配體和另一個正交適配體。當目標RNA表達時，兩個融合蛋白分別結(jié)合至RNA標簽的對應(yīng)位置，使LgBiT和SmBiT相互靠近，產(chǎn)生生物發(fā)光信號。

圖表 1. 用于多重RNA檢測的生物發(fā)光平臺。（A）用于多轉(zhuǎn)錄本成像的RNA燈籠策略示意圖。MS2外殼蛋白（MCP）和一個正交RNA結(jié)合蛋白（RBP）分別與NanoBiT片段（SmBiT和LgBiT）連接。通過將熒光蛋白（FP）與LgBiT融合，實現(xiàn)了多色發(fā)射。RNA燈籠使用PP7外殼蛋白（PCP）、噬菌體HK022 Nun蛋白（Nun）以及古菌核糖體蛋白L7Ae（L7Ae）進行設(shè)計。當燈籠與含有MS2及PP7、boxB或k-turn基序的剛性化RNA標簽結(jié)合時，發(fā)生NanoBiT互補。（B）MCP-Nun RNA燈籠（左）和MCP-L7Ae RNA燈籠（右）的結(jié)構(gòu)模型。使用PyMOL對結(jié)構(gòu)進行排列，包括MCP（紫色，PDB ID: 1ZDI）、Nun或L7Ae（黃色，分別為PDB ID: 1HJI和1RLG）、NanoLuc（PDB ID: 5IBO）（其中LgBiT以青色表示，SmBiT以深藍色表示）以及一個熒光蛋白（灰色，PDB ID: 5LK4）。

圖表 2. 正交RNA燈籠的初步評估。（A）一組三色正交RNA燈籠的示意圖。一個NanoBiT MCP-PCP燈籠結(jié)合MS2-PP7，一個VenusΔC12融合的MCP-Nun燈籠結(jié)合MS2-boxB，一個mScarlet-I融合的MCP-L7Ae燈籠結(jié)合MS2-k-turn。（B）MCP-Nun和MCP-L7Ae RNA燈籠與先前驗證過的MCP-PCP燈籠相比的初步測試。每種探針在HEK293T細胞裂解液中表達，并外源加入不同濃度（0.1?10 nM）的包含其對應(yīng)適配體（MS2與PP7、boxB或CS2）的剛性化RNA標簽。圖中繪制了相對于無RNA對照的總發(fā)光強度倍比變化。誤差線表示n=3次重復(fù)實驗的標準誤。（C）歸一化的RNA燈籠發(fā)射光譜。在表達每種燈籠的HEK293T細胞裂解液混合物中，加入正交RNA標簽（MS2-PP7和MS2-boxB標簽為1 nM，MS2-CS2標簽為100 pM）后，檢測到不同的發(fā)射光譜。歸一化光譜代表n=6次重復(fù)實驗的平均值。振幅變異小于線寬。

三、RNA 標簽的結(jié)構(gòu)優(yōu)化

在初步評估中，新構(gòu)建的MCP-Nun和MCP-L7Ae系統(tǒng)信號強度低于原有的MCP-PCP系統(tǒng)。研究人員推測，這可能與熒光蛋白的引入增加了系統(tǒng)體積有關(guān)，需要調(diào)整RNA標簽的結(jié)構(gòu)以優(yōu)化LgBiT和SmBiT的空間排列。

研究團隊合成了一系列RNA標簽變體，系統(tǒng)性地改變MS2適配體與第二個適配體之間的間隔長度和相位角度。實驗結(jié)果顯示，對于MCP-Nun系統(tǒng)，當間隔為29個核苷酸（M-29-B）時，體外信號增強倍數(shù)達到約220倍。對于MCP-L7Ae系統(tǒng)，間隔為35個核苷酸（M-35-C）時取得最佳信號，增強倍數(shù)超過100倍。

值得注意的是，較長間隔的RNA標簽在活細胞中表現(xiàn)不佳，可能與其穩(wěn)定性降低或降解速率增加有關(guān)。因此，研究人員選擇了較短的M-7-B和M-7-C標簽進行后續(xù)的細胞實驗。這些優(yōu)化后的RNA標簽保持了良好的正交性，僅與對應(yīng)的結(jié)合蛋白產(chǎn)生信號，與其他系統(tǒng)無交叉反應(yīng)。

圖表 3. RNA標簽優(yōu)化。（A）MCP-Nun和（B）MCP-L7Ae RNA燈籠在HEK293T細胞裂解液中表達時，在一系列結(jié)構(gòu)設(shè)計下的相對生物發(fā)光（A圖為1 nM，B圖為100 pM）。不同間隔長度（各柱下方以藍色突出顯示）調(diào)節(jié)了適配體之間的距離和相位角。相對發(fā)光強度表示占最大信號的百分比，其中最高平均值設(shè)為100%。（C）在不同濃度RNA標簽（0?100 nM）下，RNA燈籠的正交性。燈籠在HEK293T細胞裂解液中表達，向每種燈籠外源加入RNA標簽（M-7-P/B/C）。相對發(fā)光強度表示每種探針產(chǎn)生信號占最大信號的百分比，各彩色柱代表加入不同的正交RNA標簽。誤差線表示標準誤，（A、B）圖為n=9個樣本（來自三個生物學重復(fù)實驗，每個實驗包含三個技術(shù)重復(fù)），（C）圖為n=3個樣本。

四、活細胞驗證：實現(xiàn)亞細胞分辨率的多靶點 RNA 成像

研究團隊通過兩步實驗，在活細胞中驗證了該系統(tǒng)的多重 RNA 成像能力，實現(xiàn)了單細胞水平、亞細胞分辨率的多靶點 RNA 檢測。

圖表 4. 活細胞中模型轉(zhuǎn)錄本的多重生物發(fā)光成像。（A）編碼熒光蛋白并在3′非翻譯區(qū)包含結(jié)構(gòu)化RNA標簽的mRNA示意圖。TagRFP657（RFP）序列在3′區(qū)域引入M-7-B或M-3-P編碼。RFP-M-7-B的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致MCP-Nun燈籠組裝（黃色），RFP-M-3-P的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致MCP-PCP燈籠組裝（暗紅色）。（B）穩(wěn)定表達各燈籠的HEK293T細胞共培養(yǎng)成像。細胞未轉(zhuǎn)染（? RNA），或瞬時轉(zhuǎn)染編碼RFP-M-7-B、RFP-M-3-P或兩者（+ 所示標簽）的DNA。RFP熒光（紅色，左列）驗證了mRNA的表達。MCP-Nun和MCP-PCP探針熒光（分別為黃色和品紅色通道）指示RNA燈籠的表達。在相應(yīng)RNA標簽存在下，燈籠互補產(chǎn)生發(fā)光信號（灰色）。在M-7-B存在下，100%的發(fā)光細胞表現(xiàn)出靶向信號（MCP-Nun，15/15）。在M-3-P靶向RNA結(jié)構(gòu)存在下，81%（22/27）的發(fā)光細胞表現(xiàn)出靶向信號（MCP-PCP）。兩種RNA同時加入時，表達任一RNA燈籠的細胞均產(chǎn)生信號（12/30發(fā)光細胞表達MCP-Nun燈籠，18/30表達MCP-PCP燈籠）。比例尺 = 20 μm。

圖表 5. 活細胞中生物學多樣性轉(zhuǎn)錄本的多重成像。（A）兩種標記的目標轉(zhuǎn)錄本（mCherry-β-肌動蛋白3′非翻譯區(qū)雜合mRNA和NEAT1非蛋白編碼RNA）的示意圖。編碼任一轉(zhuǎn)錄本的DNA均經(jīng)過改造，在3′區(qū)域引入結(jié)構(gòu)化RNA標簽。預(yù)計mRNA定位于細胞質(zhì)，而非蛋白編碼RNA定位于細胞核。（B）同時表達兩種RNA燈籠和目標轉(zhuǎn)錄本的細胞代表性圖像。穩(wěn)定表達MCP-Nun燈籠的HEK293T細胞瞬時轉(zhuǎn)染表達MCP-PCP燈籠的DNA以及標記的RNA。NEAT1-M-7-B引導(dǎo)MCP-Nun燈籠在細胞核內(nèi)發(fā)生互補（綠色），而mCherry-β-肌動蛋白3′非翻譯區(qū)-M-3-P引導(dǎo)MCP-PCP燈籠在細胞質(zhì)中發(fā)生互補（藍色）。明場圖像和Hoechst核染色作為亞細胞定位的參照。相位子彩色圖像是由發(fā)光強度（以任意單位計）與通過生物發(fā)光相位子分析獲得的MCP-Nun（綠色）和MCP-PCP（藍色）探針掩膜疊加合成的。相位子彩色圖像證實了NEAT1-M-7-B的核定位和mCherry-β-肌動蛋白3′非翻譯區(qū)-M-3-P的胞質(zhì)定位。細胞3和細胞4展示了同一細胞內(nèi)的多重RNA成像。比例尺 = 20 μm。

五、技術(shù)特點與應(yīng)用前景

本研究報道的 RNA 燈籠系統(tǒng)具有以下特點：第一，采用生物發(fā)光原理，無需外部光源激發(fā)，避免了光毒性和光漂白問題；第二，通過正交RNA結(jié)合蛋白和BRET技術(shù)實現(xiàn)多重成像，可同時追蹤多種RNA分子；第三，RNA標簽長度較短（65-83個核苷酸），對目標RNA的潛在干擾較?。坏谒?，系統(tǒng)具有模塊化特征，可擴展至更多正交蛋白-適配體組合。

該系統(tǒng)的局限性包括：RNA標簽可能對目標RNA的穩(wěn)定性產(chǎn)生一定影響；信號強度與RNA表達水平之間的關(guān)系受多種因素調(diào)控，需要優(yōu)化各組分表達水平；應(yīng)用于內(nèi)源性RNA成像時需要進行基因組編輯，引入標簽序列。

總體而言，這套生物發(fā)光RNA成像系統(tǒng)為研究活細胞中RNA的定位、運輸和相互作用提供了新的技術(shù)手段。隨著進一步優(yōu)化，該系統(tǒng)有望在發(fā)育生物學、神經(jīng)科學和疾病研究等領(lǐng)域發(fā)揮作用。

原文鏈接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c16597