生物制藥高分子：FFF與SEC的對(duì)決及最佳檢測(cè)組合

針對(duì)生物制藥+高分子材料的應(yīng)用場(chǎng)景，場(chǎng)流分離（FFF）到底比HPLC/SEC好在哪？什么時(shí)候必須用FFF？

一、結(jié)論（最關(guān)鍵）

如果樣品是：

?      高分子藥用輔料（PEG、聚氨基酸、多糖、聚酯、聚氨基酸等）

?      脂質(zhì)體、LNP、外泌體、納米粒

?      蛋白聚集體、AAV、病毒樣顆粒

?      易剪切、易吸附、易在色譜柱上變性/破碎

場(chǎng)流分離（FFF）比SEC/GPC更適合，甚至是僅有可靠方法。

如果只是：

?      常規(guī)單抗、小分子蛋白、分子量不特別大的聚合物

SEC+多檢測(cè)器依然夠用、便宜、合規(guī)性更好。

二、為什么生物制藥高分子→FFF經(jīng)常優(yōu)于SEC/GPC

1.無(wú)色譜柱，無(wú)剪切，無(wú)吸附

SEC/GPC靠多孔填料分離：

?      大分子容易剪切破碎

?      脂質(zhì)體、囊泡、外泌體、軟物質(zhì)容易破膜

?      堿性蛋白、聚合物容易吸附在填料上

→結(jié)果不準(zhǔn)、回收率低、聚集體被破壞

FFF完全不同：

只有一根空管+外力場(chǎng)（離心/交叉流）分級(jí)

?      無(wú)填料

?      無(wú)孔道剪切

?      無(wú)吸附

?      樣品幾乎原生狀態(tài)被分離

2.分離范圍寬到離譜

SEC一般：幾kDa~幾百萬(wàn)Da

FFF（特別是AF4不對(duì)稱流場(chǎng)流）：1nm~1μm

覆蓋：

?      小分子聚合物

?      大分子

?      聚集體

?      納米粒

?      囊泡

?      外泌體

?      AAV

一套方法全部搞定。

3.對(duì)“聚集體”最友好

生物藥最關(guān)心：聚集體、碎片、多聚體、團(tuán)聚顆粒

SEC很容易：

?      把大聚集體篩掉

?      或剪切碎

FFF是保留原生聚集體的黃金方法。

三、生物制藥高分子必須配的3個(gè)檢測(cè)器

不管SEC還是FFF，真正決定你能不能做“結(jié)構(gòu)表征”的是檢測(cè)器。

1）MALS多角度激光散射（絕對(duì)分子量）

?      直接測(cè)絕對(duì)分子量Mw

?      測(cè)回旋半徑Rg

?      看聚集體最準(zhǔn)

?      不需要標(biāo)樣！

生物藥必配。

2）IV特性粘度檢測(cè)器（構(gòu)象、支化、粒徑）

?      測(cè)分子鏈?zhǔn)嬲钩潭?/p>

?      測(cè)流體力學(xué)體積

?      判斷：線性/支化/梳型/星型

?      脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)、PEG化、聚合物核殼結(jié)構(gòu)非常敏感

做高分子藥物、遞送載體必配。

3）DLS動(dòng)態(tài)光散射（流體力學(xué)直徑Rh）

?      直接給粒徑大小、分布

?      Rh+Rg可以判斷形狀、結(jié)構(gòu)、核殼、剛性

?      對(duì)LNP、外泌體、脂質(zhì)體特別關(guān)鍵

四、卓越組合：AF4?MALS?IV?DLS

這是生物制藥高分子材料的地表卓越組合：

?      AF4：溫和、無(wú)柱、無(wú)剪切、無(wú)吸附

?      MALS：絕對(duì)分子量+Rg

?      IV：構(gòu)象、支化、粘度

?      DLS：流體力學(xué)直徑Rh

能一次性得到：

1.    分子量分布Mw/Mn/Mz

2.    粒徑分布Rh

3.    構(gòu)象信息（Rg/Rh）

4.    支化度

5.    聚集體含量

6.    納米粒穩(wěn)定性

7.    LNP/脂質(zhì)體/外泌體完整度

SEC做不到，因?yàn)镾EC會(huì)破壞結(jié)構(gòu)。

五、什么時(shí)候必須選FFF（不能用SEC）

只要滿足任意一條，直接選FFF：

?      樣品易剪切、易破碎（脂質(zhì)體、囊泡、膠束）

?      樣品大顆粒、聚集體多（蛋白聚集體、AAV、外泌體）

?      樣品易吸附（多糖、陽(yáng)離子聚合物、堿性蛋白）

?      要1nm~1μm超寬分布

?      要原生狀態(tài)，不能被色譜柱改變

六、快速極簡(jiǎn)選型

?      常規(guī)蛋白、小聚合物→SEC–MALS–RI

?      高分子藥物、遞送系統(tǒng)、聚集體→AF4–MALS–IV–DLS

?      LNP、外泌體、脂質(zhì)體→AF4是金標(biāo)準(zhǔn)

?      要結(jié)構(gòu)、構(gòu)象、支化→必須加IV

?      要粒徑、穩(wěn)定性→必須加DLS

?      要絕對(duì)分子量→必須MALS