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顯微課堂 | Drosophila(果蠅)研究顯微鏡使用指南

來源:徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司 更新時間:2025-10-30 17:45:21 閱讀量:146
導讀:顯微課堂 | Drosophila(果蠅)研究顯微鏡使用指南


提高果蠅工作步驟的效率,促進與發(fā)育生物學、遺傳學和神經(jīng)科學有關(guān)的研究。

一個多世紀以來,果蠅(典型的黑腹果蠅)一直被用作模式生物。原因之一是果蠅與人類共享許多與疾病相關(guān)的基因。果蠅經(jīng)常被用于發(fā)育生物學、遺傳學和神經(jīng)科學的研究。果蠅的優(yōu)點包括易于飼養(yǎng)且成本低廉、繁殖速度快、基因組完全測序以及可獲得各種基因品系。使用徠卡顯微鏡可以進行高效的果蠅研究。


使用顯微鏡的進行典型果蠅

相關(guān)實驗操作步驟

使用黑腹蠅蛆的常規(guī)實驗室方法包括:

1

向胚胎顯微注射DNA進行基因改造(轉(zhuǎn)基因)。

2

通過觀察解剖特征對果蠅進行基本分類的 "揀蠅法"。

3

熒光篩選,例如觀察胚胎或幼蟲,找出成功轉(zhuǎn)染熒光蛋白的胚胎或幼蟲。

4

用于研究大腦或其他解剖結(jié)構(gòu)的解剖案例。

5

在實驗過程中對篩選出的果蠅(活體和固定的)或解剖結(jié)構(gòu)進行成像和記錄。

這些步驟通常使用體視顯微鏡、復合顯微鏡或共聚焦顯微鏡進行。

圖 1:果蠅三齡幼蟲背部展開制片,使用AlexaFluor?647標記突觸后位點,AlexaFluor?555綴合鬼筆環(huán)肽(phalloidin)標記肌動蛋白絲,并使用AlexaFluor?488標記部分運動神經(jīng)元。樣品由美國馬里蘭州貝塞斯達國家衛(wèi)生研究院/國家精神衛(wèi)生研究所(NIH/NIMH)的A. Elliott 提供。


顯微注射轉(zhuǎn)基因

果蠅的轉(zhuǎn)基因通常是通過向果蠅胚胎顯微注射DNA來完成的。進行顯微注射需要顯微鏡。


胚胎顯微注射面臨著一些挑戰(zhàn):

1

顯微鏡物鏡下有足夠的空間放置微型注射器。

2

視野小限制了同時觀察胚胎的數(shù)量。

3

傷害胚胎的風險。

4

在進行注射時保持舒適,因為注射需要重復動作,可能需要幾個小時。


使用徠卡體視顯微鏡可以克服這些挑戰(zhàn),該顯微鏡為用戶提供以下功能:

1

視野大,可同時看到多個胚胎。

2

配件使顯微鏡更符合人體工程學,最大限度地減少用戶的疲勞和勞損。

3

與市面上的顯微操作設(shè)備兼容。

圖 2:示意圖展示了將DNA微量注射到果蠅胚胎中的過程。


揀蠅

根據(jù)特定的表型或解剖特征對果蠅進行分類,即所謂的 "揀蠅",必須在顯微鏡下進行。


與揀蠅相關(guān)的挑戰(zhàn)有:

1

一些細節(jié)可能難以觀察到。

2

小視場限制了同時觀察到的果蠅數(shù)量。

3

既要有足夠高的放大倍率來觀察解剖細節(jié),又要有足夠大的景深來將果蠅按(分類)到不同的組中。

4

用于麻醉果蠅的CO2(二氧化碳)墊對底座來說太大,存在風險。


然而,使用徠卡體視顯微鏡可以克服這些挑戰(zhàn)。用戶可以獲得以下好處:

1

FusionOptics技術(shù)可同時實現(xiàn)更高的分辨率和更大的景深。

2

更舒適的設(shè)置,減少疲勞和勞損,采用人體工程學模塊。

3

使用中等大小的底座或搖臂支架,為二氧化碳墊留出足夠的空間。

圖 3:使用徠卡體視顯微鏡進行果蠅分揀操作。通過二氧化碳(CO?)管對果蠅進行麻醉(1),并在分揀過程中使用帶有 CO? 的果蠅操作墊維持麻醉狀態(tài)(2)。樣品由奧地利維也納大學神經(jīng)生物學系的T. Hummel 提供。


熒光篩選

要找到成功轉(zhuǎn)染熒光蛋白的果蠅胚胎或幼蟲,就必須對其進行熒光篩選。這項工作使用熒光體視顯微鏡進行。


對胚胎或幼蟲進行熒光篩選有一定的難度:

1

信噪比(SNR)過低導致分辨率不足,從而難以分辨不同表型的細微差別。

2

通常情況下,分辨率和景深之間存在折衷關(guān)系。

3

果蠅及其食物發(fā)出的自發(fā)熒光。

4

長時間使用顯微鏡時保持舒適。


使用徠卡體視顯微鏡可以克服這些篩選難題。它可以幫助用戶完成以下工作:

1

利用TripleBeam技術(shù)降低熒光背景噪聲,提高信噪比。

2

得益于FusionOptics技術(shù),可同時獲得高分辨率和大景深效果。

3

利用計算清除功能,即使是胚胎或幼蟲深處的細節(jié)也能清晰地顯示出來。

4

多種對比方法和專門設(shè)計的反射鏡,配備Leica透射光底座,可減少自發(fā)熒光。

5

使用人體工程學模塊,用戶可以舒適地工作,減少疲勞和勞累。

圖 4:使用THUNDER顯微鏡拍攝并經(jīng)過LVCC(大體積計算清除)處理的黑腹果蠅卵泡。綠色區(qū)域為aPKC染色,洋紅色區(qū)域為Dlg染色。樣品由美國加利福尼亞大學伯克利分校的M. Khoury和D. Bilder提供。


解剖

解剖果蠅是在必須研究大腦或其他解剖結(jié)構(gòu)時進行的。這也需要顯微鏡。


果蠅解剖面臨的挑戰(zhàn)有:

1

標本小而易碎,因此很難看到內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

2

在大腦解剖過程中,應(yīng)避免與空氣接觸。

3

實現(xiàn)速度和精度都很困難。

4

在溶液中解剖果蠅時的反光。


使用徠卡體視顯微鏡可以克服解剖難題。用戶可以利用以下優(yōu)勢:

1

利用體視顯微鏡輕松確定蠅類標本的三維方向。

2

采用人體工程學模塊,工作舒適,減少疲勞和勞累。

3

使用偏振鏡和各種照明選項可以大大減少溶液表面的反射。

圖 5:使用M125體視顯微鏡解剖的三只果蠅大腦圖像。果蠅大腦表達紅色熒光蛋白(RFP)。圖像由徠卡熒光體視顯微鏡拍攝。大腦的取向如圖所示,以便后續(xù)共聚焦成像。樣品由奧地利維也納大學神經(jīng)生物學系的L. Geid和T. Hummel提供。


成像和文件

在對果蠅進行篩選和可能的解剖之后,往往需要對實驗進行成像和記錄。這一步需要一臺帶有攝像頭和軟件的顯微鏡。


果蠅實驗成像和記錄方面的主要挑戰(zhàn)是:

1

避免蠅類標本因光和熱的照射而受損,尤其是在實時成像過程中。

2

標本移出視野。

3

由于光散射的原因,在對厚結(jié)構(gòu)或標本深處的結(jié)構(gòu)成像時,會出現(xiàn)焦外模糊的情況。

4

獲取3D標本的對焦2D圖像。


徠卡顯微鏡可以克服這些挑戰(zhàn)。以下是其優(yōu)勢:

1

使用高幀頻、高靈敏度的顯微鏡相機記錄快速事件。

2

借助計算清除功能,快速查看果蠅標本深處的細節(jié)。

3

使用寬場顯微鏡對果蠅標本進行更柔和的光照射。

4

利用擴展景深 (EDOF) 成像技術(shù)獲取整個Z疊的同焦圖像。

5

利用光片和共聚焦顯微鏡獲得更高分辨率的果蠅標本圖像。

圖 6:果蠅胚胎神經(jīng)元中鈣瞬變的時間序列成像,每幅圖像(A–F)代表約10.5秒的平均時間間隔。圖像使用THUNDER成像儀和計算清除技術(shù)獲取。樣品由美國加利福尼亞州Clandinin實驗室的A. Carreira-Rosario提供


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