圖1：Protein Select填料純化重組蛋白步驟示意圖

使用Protein Select填料純化大腸桿菌（E. coli）系統(tǒng)表達(dá)的重組綠色熒光蛋白（GFP），利用GFP熒光更加直觀的觀察蛋白與填料結(jié)合與洗脫過程。

研究不同純化溫度對Protein Select標(biāo)簽自剪切速率的影響；Protein Select使用說明中提到目的蛋白N端前三位氨基酸性質(zhì)影響Protein Select自剪切速率（表1）。

研究人員在重組GFP蛋白中驗證了N端前三位氨基酸性質(zhì)變化對于Protein Select標(biāo)簽自剪切速率的影響。

表1：目的蛋白前三位氨基酸性質(zhì)

對Protein Select標(biāo)簽自剪切速率的影響

圖2：優(yōu)化前后Protein Select tag的RNA二級結(jié)構(gòu)對比

圖3：N端前3位氨基酸性質(zhì)不同的3個GFP質(zhì)粒

重組GFP蛋白表達(dá)體積10 ml，培養(yǎng)溫度30°C，攪拌速度180 rpm，過夜培養(yǎng)。

最終通過熒光定量的方法10 ml表達(dá)體積，獲得GFP蛋白大約12 mg；另外研究發(fā)現(xiàn)含有Protein select標(biāo)簽GFP蛋白與沒有標(biāo)簽GFP蛋白相比，蛋白表達(dá)量基本沒太大變化（圖4）。

圖4：Protein Select標(biāo)簽對GFP蛋白表達(dá)量結(jié)果

溫度對Protein Select標(biāo)簽自剪切速率的影響，實驗采用GFP#1質(zhì)粒在4°C和室溫進(jìn)行對比實驗。

比較兩種條件下孵育4個小時蛋白收獲量（量度標(biāo)簽自剪切速率）和兩種溫度條件下總蛋白收獲量（間隔4小時收集一次，共進(jìn)行4次收集）。

實驗結(jié)果表明室溫條件較4°C條件Protein Select標(biāo)簽自剪切速率明顯提高，而且總蛋白收獲量也明顯提高（表2）。

表2：4°C和室溫條件下

孵育4個小時蛋白收獲量和兩種溫度條件下總蛋白收獲量

為了研究目的蛋白N端前3位氨基酸性質(zhì)對Protein Select標(biāo)簽自剪切速率的影響，研究人員構(gòu)建質(zhì)粒GFP#1、GFP#2和GFP#3（圖3）。

分別使用3個質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)和蛋白純化（室溫條件），比較孵育4個小時蛋白收獲量（量度標(biāo)簽自剪切速率）和總蛋白收獲量（間隔4小時收集一次，共進(jìn)行4次收集）（表3）。

從Protein Select標(biāo)簽自剪切速率角度看，GFP#2與GFP#1相比目的蛋白N端第二位增加一個芳香族氨基酸苯丙氨酸（F），其孵育4個小時蛋白收獲量顯著多于GFP#1孵育4個小時蛋白收獲量，表明GFP#2的標(biāo)簽自剪切效率明顯高于GFP#1。

GFP#3與GFP#2相比保留了目的蛋白N端第二位苯丙氨酸（F），但是N端第一位氨基酸替換成丙氨酸（A）同時N端第三位增加一個纈氨酸（V），實驗結(jié)果表明GFP#3標(biāo)簽自剪切速率快于GFP#2，更是明顯快于GFP#1標(biāo)簽自剪切速率（表3）。

表3：室溫條件3種質(zhì)粒表達(dá)GFP蛋白

孵育4個小時蛋白收獲量和總蛋白收獲量

Protein select標(biāo)簽的添加不會影響重組蛋白表達(dá)量。

目的蛋白N端前三位氨基酸會對標(biāo)簽自剪切速率產(chǎn)生較大影響，在質(zhì)粒構(gòu)建時需要依據(jù)Protein select 使用說明中相關(guān)建議對N端前三位氨基酸進(jìn)行優(yōu)化以提高標(biāo)簽的自剪切速率。

1.  Protein Select resin Datafile

2.  Protein Select resin Instructions for Use 29711002 AB