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精確分析生物樣本中的小分子代謝物——IC-MS在代謝組學(xué)中的應(yīng)用

來(lái)源:賽默飛色譜與質(zhì)譜中國(guó) 更新時(shí)間:2024-06-17 17:15:08 閱讀量:451
導(dǎo)讀:對(duì)極性代謝物實(shí)現(xiàn)高靈敏度、準(zhǔn)確定性定量分析

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劉甜



時(shí)至今日,代謝組學(xué)已經(jīng)成為生物組學(xué)研究領(lǐng)域的重要組成部分。通過(guò)檢測(cè)生物樣本中小分子代謝物,使得我們對(duì)于各種生物體的代謝系統(tǒng)以及代謝組與基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組在生命的分子過(guò)程中的相互作用有了深入的理解。


高分辨質(zhì)譜(HRMS)技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)和統(tǒng)計(jì)分析是當(dāng)前表征生物樣本中小分子代謝物的主要手段之一。然而,由于生物體內(nèi)代謝物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜、多樣,實(shí)現(xiàn)生物樣本中小分子代謝物的全覆蓋鑒定和準(zhǔn)確定量分析仍然是本領(lǐng)域的主要挑戰(zhàn)。其中,大極性、離子代謝物的檢測(cè)尤其受到關(guān)注。離子色譜主要使用離子交換的分離原理,和常規(guī)液相色譜主要基于疏水吸附的反相分離原理形成互補(bǔ),可以很好分離常規(guī)液相色譜難以分離的強(qiáng)極性可電離代謝物。即使是基于親水相互作用的HILIC色譜可以分離強(qiáng)極性代謝物,但也難以分離強(qiáng)電離代謝物。離子型物質(zhì)分離,必須使用離子型物質(zhì)做為流動(dòng)相,但離子型物質(zhì)本身與質(zhì)譜的最佳檢測(cè)環(huán)境并不兼容。因此,我們需要安裝膜抑制器作為一個(gè)持續(xù)工作的脫鹽裝置,通過(guò)膜轉(zhuǎn)移的原理去除對(duì)位離子,使酸堿變成純水,從而實(shí)現(xiàn)與質(zhì)譜兼容。

圖1 不同極性化合物需要不同的色譜分離系統(tǒng)進(jìn)行分析

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分離度

核苷酸、糖類等在代謝通路中存在多個(gè)同分異構(gòu)體,這些同分異構(gòu)體在細(xì)胞代謝中承擔(dān)著不同且重要的功能。因此,我們不僅需要檢出相關(guān)化合物,更需要將這些同分異構(gòu)體代謝物進(jìn)行有效色譜分離。圖2展示了IC與HILIC分析21種極性代謝物對(duì)照品的分離效果。大部分化合物在HILIC色譜柱上出峰情況良好,然而,對(duì)于磷酸糖類以及順式、反式丁烯二酸等同分異構(gòu)體代謝物來(lái)說(shuō),HILIC的分離效果明顯差于IC。在細(xì)胞樣本的測(cè)試中,不同色譜條件下對(duì)m/z 259.0224進(jìn)行提取離子流(圖3)。IC色譜條件下檢測(cè)到了11個(gè)色譜峰,檢出數(shù)量和強(qiáng)度顯著高于其他色譜條件。根據(jù)精確質(zhì)荷比信息,推測(cè)該系列化合物的元素組成為C6H13O9P,在代謝物數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索,有至少33個(gè)代謝物符合該元素組成,其中包括葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖等多種重要的磷酸單糖。

圖2 21種代謝物對(duì)照品使用IC和HILIC進(jìn)行分離的峰形比較(點(diǎn)擊查看大圖)

圖 3 細(xì)胞樣本中磷酸單糖化合物在不同色譜條件下的色譜分離比較(點(diǎn)擊查看大圖)



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靈敏度

在濃度為60 ppb(0.2-0.7 μmol/L)的情況下,使用IC-MS分析極性代謝物對(duì)照品。(圖2)這些代謝物的信噪比(S/N)約為1000,相當(dāng)于柱上量0.5-2.5 pmol。其中一半的代謝物可在非常低的濃度下(60 ppt,相當(dāng)于柱上樣量3.4 fmol以下)被檢測(cè)到,信噪比在3到20之間。最低檢測(cè)限(LODs)的濃度范圍為0.04-0.5 nmol/L(見(jiàn)表1),展示了超高靈敏度。

表1 21種代謝物在cap IC-Orbitrap平臺(tái)的最低檢測(cè)限(LODs)

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重現(xiàn)性

在連續(xù)6天的日間穩(wěn)定性考察中,每天平行測(cè)試6針對(duì)照品混標(biāo)(600 ppb),所有化合物的保留時(shí)間和響應(yīng)強(qiáng)度RSD均小于8%,完全適應(yīng)代謝組學(xué)分析要求。(圖4)在實(shí)際細(xì)胞樣本測(cè)試中,6種細(xì)胞中的11種磷酸單糖以及穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)馬尿酸-d5的色譜保留時(shí)間和響應(yīng)強(qiáng)度同樣表現(xiàn)出良好的重現(xiàn)性(n=3)。

圖4 日間重現(xiàn)性考察(n=6)

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圖5 不同細(xì)胞樣本中11種磷酸單糖的離子流圖

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代謝通路覆蓋度

采用IC-MS的方法進(jìn)行細(xì)胞代謝組學(xué)分析,幾乎完整地覆蓋了糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)(TCA)的主要代謝物。(圖6)通過(guò)相關(guān)測(cè)試結(jié)果,可以幫助我們有效觀察細(xì)胞能量代謝、代謝穩(wěn)態(tài)的變化。

圖6 糖酵解、TCA代謝途徑及細(xì)胞樣本中相關(guān)代謝物含量測(cè)試結(jié)果(點(diǎn)擊查看大圖)



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小結(jié)

離子抑制技術(shù)的發(fā)展,特別是連續(xù)電解離子抑制技術(shù),使得離子交換色譜與高分辨質(zhì)譜的結(jié)合成為可能,這種組合帶來(lái)了新的分析機(jī)會(huì)。IC-MS平臺(tái)技術(shù)的商業(yè)化推廣使得越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室探索了IC-MS的新應(yīng)用領(lǐng)域,并揭示了超出傳統(tǒng)應(yīng)用領(lǐng)域的成功案例。例如,除了對(duì)無(wú)機(jī)離子的分析外,有機(jī)和生物極性和離子分析物已經(jīng)成功地在廣泛的環(huán)境和生物樣品類型中進(jìn)行了有針對(duì)性的分析和表征。使用離子抑制的IC-MS分析具有產(chǎn)生洗脫劑和極性選擇性的組合特性,減少了有效基質(zhì)復(fù)雜性,降低了質(zhì)譜檢測(cè)中可能導(dǎo)致分析干擾的基質(zhì)效應(yīng)和色譜擁擠。分析物通常已經(jīng)處于離子形式;因此,通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)實(shí)現(xiàn)高靈敏度分析可以最大程度地減少離子抑制。相比之下,用于離子和高極性分析物表征的其他色譜方法(如RP-MS、HILIC-MS、GC-MS和IP-MS)可能抑制分析物的離子特性(使用低質(zhì)子溶劑、衍生化等),以便提供有效的分析條件,這可能導(dǎo)致覆蓋范圍和信號(hào)抑制的偏差??傊?,IC-MS已經(jīng)成為一種有效的互補(bǔ)(或替代)分析工具,表現(xiàn)出高水平的平臺(tái)穩(wěn)定性、保留時(shí)間重現(xiàn)性、靈敏度和低檢測(cè)限。迄今為止,大多數(shù)應(yīng)用集中在法醫(yī)科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、技術(shù)和制造業(yè)以及食品化學(xué)領(lǐng)域。然而,在制藥科學(xué)、臨床化學(xué)、診斷學(xué)、微生物學(xué)、代謝組學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越多,這些領(lǐng)域還有許多重要的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用的空間(圖5)。無(wú)論是在復(fù)雜基質(zhì)中還是在高極性或離子分析物中,IC-MS都有新的應(yīng)用空間。展望未來(lái),我們認(rèn)為IC-MS的未來(lái)應(yīng)用將包括對(duì)復(fù)雜生物和環(huán)境系統(tǒng)和過(guò)程的深入研究,宿主-病原體關(guān)系,微生物組代謝,植物與土壤化學(xué)之間的關(guān)系,藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué),以及與疾病的診斷、預(yù)后和病因相關(guān)的生物標(biāo)志物研究。從傳統(tǒng)意義上講,這些領(lǐng)域在分析上具有特殊的挑戰(zhàn)性,特別是在使用非靶向方法時(shí);因此,IC-MS在發(fā)現(xiàn)導(dǎo)向和有針對(duì)性應(yīng)用中有潛力發(fā)揮重要作用。

參考文獻(xiàn):

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