Xu S , Gavin J , Jiang R ,et al.Bioreactor productivity and media cost comparison for different intensified cell culture processes[J].Biotechnology Progress, 2017, 33(4).DOI:info:doi/10.1002/btpr.2415.

介紹：

采用同一培養(yǎng)基對同一株CHO細胞系進行補料培養(yǎng)（fed-batch正常接種密度）或補料培養(yǎng)（fed-batch，N-1灌流再高接種密度）、灌流和濃縮補料批培養(yǎng)（CFB）三種細胞培養(yǎng)操作模式的評價。可比較的細胞比生產率(補料批：29.4 pg/cell/day；N-1灌流補料批：32.0 pg/ cells /day；灌流：31.0 pg/細胞/天；在相同的培養(yǎng)基條件下，CFB為20.1 ~ 45.1 pg/cell/day)。灌流（高達2.29 g/L/day）和CFB（高達2.04 g/L/day）的生物反應器生產率遠遠高于補料批培養(yǎng)（范圍為0.39至0.49 g/L/day）。此外，發(fā)現灌流產生的每克抗體的培養(yǎng)基成本與補料批的培養(yǎng)基成本相當；而CFB因其培養(yǎng)時間短，其培養(yǎng)基成本最高。只要達到足夠的生物反應器生產率，灌流過程的培養(yǎng)基成本甚至可以低于補料工藝。

目前，大部分的生產能力是為補料批工藝建立的。補料批工藝的峰值細胞密度在20-30×10⁶個細胞/mL，18天內達到了>10g/L的高滴度水平。灌流工藝傳統(tǒng)上用于生產不穩(wěn)定的產品，如凝血因子和酶產品。在灌流培養(yǎng)中，連續(xù)培養(yǎng)基交換用于減少產物在生物反應器中的停留時間，灌流速率可根據特定產品和/或工藝要求而變化。

由于對成本和空間減少以及設施靈活性的期望，基于灌流的工藝強化在上游培養(yǎng)中獲得了相當大的動力。通常可以實現50-60×10⁶個細胞/mL的穩(wěn)定細胞密度，最近有報道稱，在每個生物反應器每天2個培養(yǎng)基交換體積（vvd）下，單克隆抗體生產的生物反應器生產率高達4g/L/天。在維持1.9 g/L/day的生物反應器生產力的同時，還可以實現15 pL/ cells /day的極低細胞特異性灌流率（CSPR）（培養(yǎng)基交換率為1 vvd）。濃縮補料（CFB）工藝也采用培養(yǎng)基交換來保持較高的細胞密度，同時保留生物反應器中的產物。

本文展示了使用相同的基礎培養(yǎng)基和補料液，開發(fā)具有高生物反應器生產率的不同細胞培養(yǎng)工藝（補料、灌流和CFB）。進一步比較了不同工藝模式下的生物反應器生產率及其相關的培養(yǎng)基成本。

三種不同工藝模式

不同工藝模式下的細胞培養(yǎng)性能

均采用相同的3 L生物反應器配置：補料、灌流和濃縮補料（CFB）。在所有三種工藝模式中都使用了相同的基礎培養(yǎng)基和補料（feed-a和feed-b）。

補料批培養(yǎng)

補料批培養(yǎng)數據

補料批方式接種密度為0.5或2×10⁶個/mL。在2×10⁶個細胞/mL的條件下使指數生長期縮短2天，第8天密度達到峰值，而不是在0.5×10⁶細胞/mL的接種密度條件下第10天。兩種條件下的峰值細胞密度均在20.2-26.2×10⁶cells/mL范圍內。0.5×10⁶個細胞/mL接種密度條件下，最終存活率為92.5±0.9%，2×10⁶個細胞/mL接種密度條件下，最終存活率為82.4±4.8%。在早期指數階段產生有限的抗體。兩種條件下，從指數期到穩(wěn)定期的后期，產品滴度均以每日0.55-0.63g/L的速率增加，表明兩種條件下的生產速率具有可比性。第14天滴度為5.4±0.1 g/L（qP為29.4±2.2 pg/cell/day）和6.8±0.2 g/L (qP為32.0±2.3 pg/cell/day)

生物反應器容量產率計算為最終生物反應器滴度除以培養(yǎng)時間。2×10⁶細胞/mL接種密度條件下的體積產率（VPR）高于0.5×10⁶細胞/mL接種密度條件下的（0.49±0.01 g/L/d vs.0.39±0.01 g/L/d)，主要是因為它縮短了初始生長階段的時間，延長了生產階段。高接種密度條件下，補料量以葡萄糖水平為基礎，與細胞密度有關，因此補料量較高。0.5×10⁶個細胞/mL接種密度條件下，平均補料量為48%（占生物反應器初始體積的百分比），2×10⁶個細胞/mL接種密度條件下，平均補料量為52%。這可能是在2×10⁶個細胞/mL接種密度條件下qP略高的原因。

灌流培養(yǎng)

灌流培養(yǎng)數據

整個灌流培養(yǎng)過程中保持>85%的高活力。在基礎培養(yǎng)基條件下，平均細胞密度維持在44.0±4.1×10⁶個細胞/mL，從第8天到第32天的日生產力為0.70±0.04 g/L/天。在灌流培養(yǎng)中，由于產品直接從灌流側收獲，因此生物反應器的體積生產力計算為灌流滴度×灌流率。到灌流培養(yǎng)結束時，每日產物收獲率（灌流滴度/生物反應器滴度）仍在80%。

在基礎培養(yǎng)基+補料條件下，隨著細胞密度的增加，逐漸加入feed-a作為交換培養(yǎng)基的一部分，同時總交換培養(yǎng)基保持1vvd。增加總培養(yǎng)基交換中feed-a的含量，直到第12天達到總培養(yǎng)基交換的10%，并在剩余的培養(yǎng)時間內保持該水平。隨著補料添加量的增加，平均細胞密度增加到73.9±5.4×10⁶個細胞/mL，每日生物反應器體積生產力增加到2.29±0.28 g/L/day。與僅在基礎培養(yǎng)基條件下相比，增加培養(yǎng)基可提高穩(wěn)定細胞密度和滴度。

總體而言，細胞特異性生產力從16.0±1.2 pg/cell/day增加到30.1±2.3 pg/cell/day。結果表明，在基礎培養(yǎng)基+補料條件下，生物反應器生產率提高了230%。

濃縮補料批（CFB）

濃縮補料培養(yǎng)數據

與灌流過程類似，對僅基礎培養(yǎng)基條件和基礎+補料條件進行評估。添加額外的補料可提高細胞培養(yǎng)性能和體積生產力。僅在基礎培養(yǎng)基條件下，峰值細胞密度達到72.0±9.6×10⁶個細胞/mL，第18天的上清滴度為12.2±0.6 g/L。對于基礎培養(yǎng)基+補料條件，在培養(yǎng)基交換中評估兩種不同的補料量：條件1使用6%的feed-a和2%的feed-b，條件2使用8%的feed-a和8%的feed-b。條件1產生的峰值細胞密度為117.4×10⁶個細胞/mL，第18天的上清滴度為21.4 g/L。條件2的峰值細胞密度為83.4×10⁶個/mL，第18天上清滴度為36.7 g/L。在條件2中，當feed-a和feed-b的添加量增加時，細胞比生產力顯著提高到45.1 pg/cell/day。獲得的qP與高生產率補料批工藝中報告的水平相似。雖然基礎培養(yǎng)基+補料條件下的存活率下降速度快于單獨純基礎培養(yǎng)基條件，但最終存活率仍維持50%~70%。在完全相同的培養(yǎng)條件下（例如，僅基礎培養(yǎng)基條件），基于ATF的CFB工藝（50kD）可以產生比灌流（0.2μm）更高的活細胞密度。

細胞特異性生產率、生物反應器生產率和產品質量

為了比較不同工藝間qP和VPR的差異，當僅使用基礎培養(yǎng)基時，批培養(yǎng)、灌流和CFB處理的qP范圍為14.7-17.1 pg/cell/day。批量培養(yǎng)的VPR僅為0.08 g/L/day，而灌流和CFB工藝由于保持了較高的細胞密度，VPR在0.68 - 0.70 g/L/day之間。補料培養(yǎng)qP提高到29.4 ~ 32.0 pg/ cells/ day，VPR達到0.39 g/L/day （0.5×10⁶個細胞/mL接種密度）或0.49 g/L/day（2×106個細胞/mL接種密度），N-1灌流的高接種密度提高了VPR，因為它縮短了生長期的時間，延長了生產力高的穩(wěn)定期的持續(xù)時間。然而，在灌流和CFB過程中，由于細胞密度的顯著差異，補料批培養(yǎng)的VPR仍然低于基礎條件下的VPR。在灌流培養(yǎng)中添加10%的feed-a，與僅在基礎條件下相比，VPR提高了約230% (2.29 g/L/day vs. 0.70 g/L/day)，qP提高了約90%（30.1 pg/cell/day vs. 16.0 pg/cell/day）。同樣，在CFB工藝中，添加不同比例的feed-a和feed-b可將VPR提高至1.19 g/L/d（6%feed-a + 2%feed-b）和2.04 g/L/d（8%feed-a + 8%feed-b）。

所有工藝均獲得了可接受的電荷變化曲線和聚集水平。與其他兩種工藝相比，CFB工藝產生了更高水平的HMW和略高的酸性變體，這主要是由于產品所處的細胞培養(yǎng)環(huán)境。產品在補料批和CFB中的停留時間可達整個培養(yǎng)周期，其中CFB工藝的停留時間最長。盡管如此，產生的HMW小于5%，并且大多數可以通過純化步驟清除。

對于傾向于聚集的分子，需要仔細檢查CFB工藝，以確保可接受的產品質量屬性。例如,當CFB工藝延長到29天,在基礎培養(yǎng)基條件下觀察到酸性變異和高分子量的增加，即使產品抗體濃度也大幅增加。另一方面,即使在相同的高細胞密度環(huán)境和培養(yǎng)基成分相似,灌流培養(yǎng)產生低酸性變異和高分子量低,可能是因為產品的短停留時間在生物反應器(1vvd使用,產品連續(xù)運出生物反應器，停留時間為3天）。總的來說，所有的工藝模式和培養(yǎng)基條件都產生了可接受的電荷變化和聚集曲線。

培養(yǎng)基成本分析

當只使用基礎培養(yǎng)基時，每克抗體的培養(yǎng)基成本在補料批和灌流過程中都很高。當在補料批和灌流過程中使用適量的補料時，可以降低每克mAb培養(yǎng)基成本。盡管補料比基礎培養(yǎng)基貴，但細胞密度和qP的增加比培養(yǎng)基成本的增加更為顯著。N-1灌流補料的培養(yǎng)基成本低于正常補料批，這是由于在N-1灌流過程中，只需3倍的基礎培養(yǎng)基交換即可獲得高接種密度，并且滴度的增加超過了培養(yǎng)基使用量的增加。兩種條件下，N-1灌流和灌流（基礎培養(yǎng)基+10%feed-a）的補料批的培養(yǎng)基成本相當，約為10美元/g mAb。在灌流培養(yǎng)中需要3 vvd的灌流率才能保持60×10⁶個細胞/mL的細胞密度，并且預計1 vvd的改進過程可以保持相同的細胞密度，從而使灌流工藝在CoGs（cost of goods）方面有利。

CFB的培養(yǎng)基成本不符合其他工藝模式的趨勢。在基礎培養(yǎng)基條件下，成本（17.5美元/g mAb）與批培養(yǎng)和灌流工藝相當。與補料批和灌流不同，在CFB工藝中使用補料液時，培養(yǎng)基成本實際上增加了。例如，當使用補料條件1時，成本增加到19.6美元/g mAb。在這種特殊情況下，生物反應器生產率的提高不足以彌補與所使用的補料培養(yǎng)基相關的高成本。在補料條件1下，邊際細胞比生產力由17.1±1.3 pg/cell/day提高到20.1 pg/cell/day。隨著條件2補料量的進一步增加，qP和VPR均顯著提高。結果，培養(yǎng)基成本降至17.0美元/g mAb，僅略低于基礎條件下17.5美元/g mAb的培養(yǎng)基成本。與CFB工藝相關的高培養(yǎng)基成本主要是由于需要相當長的細胞生長時間。直到培養(yǎng)第10天細胞密度達到峰值水平時，滴度才顯著增加。因此，盡管在補料條件2下，CFB工藝的qP和日生產率很高，但每g mAb的培養(yǎng)基成本遠高于補料批和灌流工藝的10美元/g mAb。對于CFB工藝，降低培養(yǎng)基成本的一種方法是延長批次長度，提高使用壽命；然而，這必須仔細檢查，因為在生物反應器中停留時間較長可能會影響產品質量屬性。當CFB延長到更長的持續(xù)時間時，已經觀察到酸性變體和HMW的增加。

總    結

比較了不同工藝模式下的生物反應器生產率，包括補料、灌流和CFB工藝。與灌流培養(yǎng)（灌流培養(yǎng)為2.29 g/L/d，CFB培養(yǎng)為1.19 - 2.04 g/L/d）相比，補料培養(yǎng)具有最低的生物反應器生產率（0.39 - 0.49 g/L/d），因為維持的細胞密度要低得多。灌流的顯著優(yōu)勢是能夠達到并保持非常高的細胞密度，以形成產物，這可以抵消在基礎條件下相對較低的qP。灌流的一個缺點是涉及高培養(yǎng)基成本，因為需要連續(xù)的培養(yǎng)基交換來維持所需的高活細胞密度。高產量灌流培養(yǎng)的培養(yǎng)基成本（2.29±0.28 g/L/d）實際上可以低于補料工藝（第14天滴度為6.8±0.2 g/L）。這部分是由于灌流時使用的低細胞特異性灌流率（14±1 pL/細胞/天）在18天內達到36.7 g/L的上清滴度。CFB工藝的培養(yǎng)基成本也是最高的。這在很大程度上是由于CFB培養(yǎng)沒有灌流培養(yǎng)那么長，而且培養(yǎng)時間的很大一部分用于細胞生長而不是產物形成。