摘要

黑麥染色質(zhì)檢測對麥類作物遺傳改良至關(guān)重要。本研究利用熒光原位雜交技術(shù)（FISH），結(jié)合威尼德 HB-500 原位雜交儀，針對黑麥染色體特異性序列進行精準定位。通過設(shè)計特異性探針并優(yōu)化雜交條件，成功在根尖細胞與花粉母細胞中清晰顯示黑麥染色質(zhì)分布，為麥類遠緣雜交育種及染色體進化研究提供了高效技術(shù)方案。

一、引言

黑麥（Secale cereale）作為麥類作物重要的遺傳資源，其染色質(zhì)中蘊含的抗病、抗逆基因是小麥品種改良的關(guān)鍵靶點。準確檢測黑麥染色質(zhì)在雜種后代中的存在與分布，是麥類遠緣雜交育種的核心環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的細胞學方法如吉姆薩染色，雖能觀察染色體形態(tài)，但難以精確識別黑麥特異性染色質(zhì)片段；分子標記技術(shù)（如 SSR、STS）雖可鑒定遺傳物質(zhì)，卻無法直觀呈現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)與整合位點。

熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in situ hybridization, FISH）通過熒光標記的 DNA 探針與靶染色體序列特異性結(jié)合，能夠在細胞水平直接定位目標染色質(zhì)，具有可視化程度高、特異性強、可定量分析等優(yōu)勢。該技術(shù)尤其適用于檢測異源染色質(zhì)在宿主基因組中的整合模式，為解析麥類作物遺傳漸滲機制提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)。

威尼德 HB-500 原位雜交儀作為分子病理研究的核心設(shè)備，為植物染色體 FISH 檢測提供了精準可控的實驗平臺。其搭載的模糊 PID 智能算法與熱蓋控溫技術(shù)，實現(xiàn) 12 張玻片全域溫差≤±1℃，確保雜交過程中溫度均一性，避免因溫度波動導致的探針非特異性結(jié)合；全密封濕度控制系統(tǒng)維持≥90% RH 恒濕環(huán)境，有效防止雜交液揮發(fā)，提升探針與靶序列的結(jié)合效率。儀器支持全自動變性 - 雜交一體化流程，配合 7 英寸智能觸控屏與 110 組用戶程序預(yù)設(shè)功能，顯著簡化操作步驟，縮短實驗周期，為植物染色體精細分析提供了技術(shù)保障。本研究旨在建立基于威尼德 HB-500 原位雜交儀的黑麥染色質(zhì)檢測方法，驗證其在植物遺傳育種中的應(yīng)用價值。

二、材料與方法

（一）實驗材料

1. 1. 植物樣本：

• 黑麥（Secale cereale L.）品種‘冬黑麥 1 號’，由某農(nóng)業(yè)科學院提供，取根尖分生組織（用于體細胞染色質(zhì)檢測）及孕穗期幼穗（用于花粉母細胞減數(shù)分裂觀察）。

• 對照樣本：普通小麥（Triticum aestivum L.）品種‘揚麥 18’，用于背景信號排除及探針特異性驗證。

2. 2. 探針：

• 黑麥特異性重復序列探針 pSc119.1（標記為綠色熒光，激發(fā)波長 488 nm），靶向黑麥染色體端部異染色質(zhì)區(qū)；

• 小麥 5S rDNA 探針（標記為紅色熒光，激發(fā)波長 570 nm），用于染色體核型對照，探針由某生物科技公司合成并純化。

（二）主要試劑

實驗所用試劑包括某試劑（用于細胞固定、探針稀釋及雜交緩沖液配制）、4% 多聚甲醛（pH 7.2）、1×PBS 緩沖液、20×SSC（含 3 M NaCl，0.3 M 檸檬酸鈉，pH 7.0）、甲酰胺、硫酸葡聚糖、鮭魚精 DNA、DAPI 復染劑（1 μg/mL）、抗熒光淬滅封片劑等，均為分析純級別。

（三）主要儀器

威尼德 HB-500 原位雜交儀（具備精準控溫、全自動變性 - 雜交功能，支持 12 張玻片并行處理）、熒光顯微鏡（配備 UV、綠光、紅光激發(fā)模塊）、高速冷凍離心機、恒溫水浴鍋、顯微操作儀、移液器、酶標儀等。

（四）實驗方法

1. 細胞樣本制備

• 1. 根尖細胞：取黑麥種子萌發(fā)根尖（1-2 cm），經(jīng) 0.002 M 8 - 羥基喹啉預(yù)處理 2 h（室溫），卡諾固定液（甲醇：冰乙酸 = 3:1）固定 24 h，系列乙醇（70%、85%、100%）脫水，-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

• 2. 花粉母細胞：剝?nèi)『邴溤兴肫谟姿耄ㄋ腴L 3-5 cm），卡諾固定液固定 24 h，梯度乙醇脫水后，取花藥置于載玻片上，滴加 1×PBS 緩沖液，鑷子輕壓破碎細胞，室溫晾干。

2. 玻片預(yù)處理與樣本變性

將固定后的根尖細胞或花粉母細胞樣本玻片放入威尼德 HB-500 原位雜交儀，70℃烘烤 2 h 增強細胞粘附力。隨后依次用 2×SSC（37℃，10 min）、胃蛋白酶溶液（10 μg/mL，37℃，5 min）處理以消化細胞質(zhì)蛋白，再次經(jīng) 70%、85%、100% 乙醇脫水，室溫晾干。

3. 探針制備與雜交程序

• 1. 探針混合：將 pSc119.1 探針與 5S rDNA 探針分別以 1:50 比例溶于雜交緩沖液（含 50% 甲酰胺，10% 硫酸葡聚糖，2×SSC，100 μg/mL 鮭魚精 DNA），充分混勻后加入儀器探針槽。

• 2. 變性與雜交：啟動威尼德 HB-500 原位雜交儀的 “全自動雜交模式”，首先在 75℃對探針混合液變性 10 min，立即冰浴 5 min；隨后將變性后的探針滴加于樣本玻片，覆蓋蓋玻片并密封，儀器自動升溫至 42℃預(yù)雜交 1 h，再降至 37℃進行過夜雜交（16-18 h）。過程中儀器實時監(jiān)控溫度（全域溫差≤±1℃）與濕度（≥90% RH），確保探針高效結(jié)合。

4. 洗片與信號檢測

雜交結(jié)束后，依次用 2×SSC（37℃，5 min）、1×SSC（37℃，10 min）、0.5×SSC（37℃，10 min）洗片以去除未結(jié)合探針，蒸餾水漂洗后晾干。滴加 DAPI 復染劑（1 μg/mL）室溫孵育 10 min，抗熒光淬滅封片劑封片。

在熒光顯微鏡下觀察，pSc119.1 探針信號呈綠色熒光，定位黑麥染色體端部；5S rDNA 信號呈紅色熒光，標記小麥染色體核仁組織區(qū)；DAPI 復染細胞核呈藍色熒光。每個樣本隨機選取 20 個分裂相細胞，記錄熒光信號的數(shù)量、位置及強度。

三、結(jié)果與分析

（一）探針特異性驗證

在普通小麥對照樣本中，僅檢測到紅色熒光信號（5S rDNA 標記的小麥染色體），無綠色熒光信號；而在黑麥根尖細胞中，所有染色體端部均顯示強烈綠色熒光，與預(yù)期的 pSc119.1 探針結(jié)合位點一致，表明探針具有高度特異性，可準確識別黑麥染色質(zhì)。

（二）黑麥染色質(zhì)檢測結(jié)果

1. 1. 體細胞染色體定位：黑麥根尖細胞有絲分裂中期染色體顯示，每條染色體端部均存在綠色熒光信號，呈對稱分布；與小麥 - 黑麥異源六倍體雜種細胞對比，可清晰分辨黑麥染色體（攜帶綠色信號）與小麥染色體（僅紅色信號），證明該方法能有效區(qū)分異源染色質(zhì)。

2. 2. 減數(shù)分裂期染色體行為：黑麥花粉母細胞減數(shù)分裂中期 Ⅰ，同源染色體聯(lián)會形成二價體，綠色熒光信號集中于染色體端部，顯示黑麥染色質(zhì)在減數(shù)分裂中的穩(wěn)定傳遞；在小麥 - 黑麥雜種花粉母細胞中，觀察到黑麥染色質(zhì)與小麥染色體的部分聯(lián)會現(xiàn)象，為解析遠緣雜交親和性機制提供了細胞學證據(jù)。

（三）威尼德 HB-500 原位雜交儀性能評估

• 1. 控溫精度：實驗過程中 12 張玻片溫度波動始終≤±1℃，避免了因局部過熱或降溫導致的探針脫靶或背景信號升高，確保不同玻片間信號強度一致（變異系數(shù)＜5%）。

• 2. 流程效率：全自動變性 - 雜交程序?qū)鹘y(tǒng)手動操作所需的 24-30 h 縮短至 18-20 h，且 “開蓋即操作” 的玻片卡槽設(shè)計減少了人工干預(yù)，降低污染風險。

• 3. 數(shù)據(jù)可溯性：儀器實時記錄溫度曲線并支持數(shù)據(jù)導出，為實驗重復性驗證提供了量化依據(jù)，符合學術(shù)研究對質(zhì)控體系的嚴格要求。

四、結(jié)論

本研究建立了基于威尼德 HB-500 原位雜交儀的黑麥染色質(zhì) FISH 檢測方法，實現(xiàn)了黑麥特異性序列在體細胞與減數(shù)分裂細胞中的精準定位。該方法克服了傳統(tǒng)細胞學技術(shù)的局限性，為麥類作物遠緣雜交育種中異源染色質(zhì)的追蹤、鑒定及遺傳效應(yīng)分析提供了可靠工具。

威尼德 HB-500 原位雜交儀憑借其精準控溫、高效流程及智能互聯(lián)優(yōu)勢，顯著提升了植物染色體 FISH 實驗的穩(wěn)定性與操作效率。無論是作物遺傳育種中的外源基因定位，還是染色體進化研究中的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，該儀器均能為科研人員提供高精度、可重復的檢測方案。

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