在細(xì)胞培養(yǎng)的道路上，遇到細(xì)胞聚團(tuán)問題總是讓人頭疼不已。作為一位擁有十年細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗的“老司機”,今天就來和大家聊聊細(xì)胞聚團(tuán) 那些事，分享如何分析原因并有效解決這個問題。

細(xì)胞聚團(tuán)不僅僅是形態(tài)上的變化，它會嚴(yán)重影響細(xì)胞的正常生長、代謝功能及實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

聚團(tuán)會導(dǎo)致細(xì)胞間營養(yǎng)和氧氣交換受限，部分細(xì)胞因養(yǎng)分不足無法正常生長分裂。聚團(tuán)細(xì)胞的生長狀態(tài)往往不均勻，有的增殖旺盛，有的則處于休眠或瀕死狀態(tài)。細(xì)胞在聚團(tuán)后常失去正常粘附狀態(tài)，影響其功能表現(xiàn)，如分泌能力和代謝活性。在需要細(xì)胞與基質(zhì)或其他細(xì)胞 相互作用的實驗中，聚團(tuán)會干擾這些生物學(xué)過程。

聚團(tuán)還可能導(dǎo)致細(xì)胞行為不一致，影響實驗結(jié)果的可重復(fù)性。在藥物篩選或功能研究中，聚團(tuán)可能改變細(xì)胞對藥物的反應(yīng)，產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果。

1.細(xì)胞自身特性：有些細(xì)胞天生就愛“抱團(tuán)“

有些細(xì)胞由于其自身生長特性，本身就傾向于聚團(tuán)生長。例如，NK92細(xì)胞正常生長時就會自然以聚大團(tuán)的形式懸浮生長，而U2932細(xì)胞則常以單個或簇狀（即聚成小團(tuán)）的形式生長。

應(yīng)對策略：對于這類細(xì)胞，建議先查閱權(quán)威數(shù)據(jù)庫中的細(xì)胞正常生長圖片，了解其易聚團(tuán)特性，無需過度處理。

2、消化不當(dāng)：過度或不足都不可取

消化過程是導(dǎo)致細(xì)胞聚團(tuán)的重要因素。消化過度(濃度過高或時間過長)會損傷細(xì)胞，影響其正常粘附能力；消化不足則會使細(xì)胞大片脫落，細(xì)胞間粘附仍然較強，難以分散成單細(xì)胞懸液。

應(yīng)對策略：需要精準(zhǔn)掌控消化時間，既要保證細(xì)胞充分解離，又要避免影響細(xì)胞狀態(tài)。對于已聚團(tuán)且狀態(tài)良好的細(xì)胞，可進(jìn)行消化處理以 獲得單細(xì)胞懸液并重新接種。

3、血清影響：批次差異不容小覷

不同品牌和批次的血清在成分上存在差異，尤其是生長因子的含量，這可能會對細(xì)胞粘附能力和生長狀態(tài)產(chǎn)生影響，引發(fā)聚團(tuán)。

應(yīng)對策略：培養(yǎng)對血清敏感的細(xì)胞時，應(yīng)盡量避免更換血清品牌和生產(chǎn)批次。如必須更換，建議采取逐步替換的方式。

4、培養(yǎng)條件：環(huán)境不穩(wěn)定促使細(xì)胞“抱團(tuán)取暖”

培養(yǎng)箱溫度、濕度和CO?濃度不穩(wěn)定會影響細(xì)胞正常代謝和生理功能，細(xì)胞為抵御不良環(huán)境而聚團(tuán)。高密度培養(yǎng)時，細(xì)胞也容易出現(xiàn)聚團(tuán)生長 。

應(yīng)對策略 ：定期校準(zhǔn)培養(yǎng)箱監(jiān)測裝置，確保環(huán)境穩(wěn)定。通過預(yù)實驗確定細(xì)胞最佳接種密度，避免過高密度，并及時傳代。

5、其他原因：多種因素需考慮

離心速度過大或時間過長也容易造成細(xì)胞抱團(tuán)。細(xì)胞狀態(tài)不好、老化(如換液不及時、長得太滿才傳代、污染等)可能出現(xiàn)抱團(tuán)。污染：某些細(xì)菌和真菌病原體會導(dǎo)致細(xì)胞溶解，結(jié)塊通常是細(xì)胞培養(yǎng)物被污染的跡象。

1、化學(xué)分散法：添加劑來幫忙

對于無血清懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞株(如HEK 293F和CHO-S)，在高密度培養(yǎng)時容易出現(xiàn)聚團(tuán)。可在培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)目辜?xì)胞結(jié)團(tuán)劑，能有效改善聚團(tuán)情況。

低分子量葡聚糖硫酸鈉(Dextran sulfate sodium salt,DSS)可通過改變細(xì)胞表面電荷，促使單個細(xì)胞懸浮，防止結(jié)團(tuán)。對于CHO細(xì)胞，推薦濃度為10-50mg/L。

DNA酶I:可添加到培養(yǎng)基中，分解從破裂細(xì)胞中釋放的DNA,減少因DNA纏繞導(dǎo)致的細(xì)胞團(tuán)塊。但需注意使用量，過多可能導(dǎo)致細(xì)胞突變。

2、操作優(yōu)化法：細(xì)節(jié)決定成敗

3、物理分散法：機械手段解難題

對于已形成的細(xì)胞團(tuán)，可嘗試溫和機械方法分散，如用移液器輕輕吹打聚團(tuán)部位。對于較緊密的聚團(tuán)，可使用低濃度胰或其他解離酶 (如膠原酶)短時間處理。讓細(xì)胞靜置片刻，然后吸取上半部分沒有抱團(tuán)的細(xì)胞懸液來傳代。

大鼠背根神經(jīng)元細(xì)胞在常溫運輸過程中可能因刺激導(dǎo)致細(xì)胞聚團(tuán)漂浮。處理方法是收集聚團(tuán)細(xì)胞，用胰酶消化后重新鋪板。經(jīng)過24小時培養(yǎng)，細(xì)胞開始貼壁，形態(tài)逐漸伸展，繼續(xù)培養(yǎng)2天后，細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常。

• 聲懸浮技術(shù)：法國研究人員開發(fā)了一種多陷波聲波懸浮技術(shù)，已成功使間充質(zhì)干細(xì)胞保持懸浮狀態(tài)長達(dá)24小時。在培養(yǎng)過程中， MSC自發(fā)地從細(xì)胞片自組織為細(xì)胞團(tuán)簇。

• 微腔陣列技術(shù)：研究者開發(fā)了一種基于微工程水凝膠薄膜的高通量類器官培養(yǎng)技術(shù)，能夠在傳統(tǒng)多孔板底部生成微腔陣列，從而在無固體 基質(zhì)條件下同時培養(yǎng)數(shù)千個均勻的類器官。

細(xì)胞聚團(tuán)是細(xì)胞培養(yǎng)中的常見問題，但并非不可解決。關(guān)鍵在于仔細(xì)觀察、分析原因并采取針對性措施。作為有十一年經(jīng)驗的細(xì)胞培養(yǎng)人，我建議大家：

文獻(xiàn)參考：

1.Jeger-Madiot N,Arakelian L,Setterblad N, et al. Self-organization and culture of Mesenchymal Stem Cell spheroids in acoustic levitation. Sci Rep.2021;11(1):8355. doi:10.1038/ s41598-021-87459-6.

2.Freshney,R.I.《動物細(xì)胞培養(yǎng)——基本技術(shù)和特殊應(yīng)用指南》.科學(xué)出版社，2019.