細(xì)胞培養(yǎng)箱是提供穩(wěn)定的溫度（37°C）、穩(wěn)定的CO2水平（5%）、恒定的酸堿度（pH值：7.2-7.4）、較高的相對(duì)飽和濕度（95%），來(lái)對(duì)細(xì)胞/組織進(jìn)行體外培養(yǎng)的一種裝置。下面就讓小編為你介紹一下細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的方法。

一、細(xì)胞復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)在無(wú)菌的環(huán)境下進(jìn)行操作至關(guān)重要，實(shí)驗(yàn)操作時(shí)需要戴上手套并用酒精對(duì)手套進(jìn)行消毒處理。

1.為了確保實(shí)驗(yàn)在無(wú)菌的環(huán)境中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)需要用照射消毒半個(gè)小時(shí)，實(shí)驗(yàn)所需的無(wú)菌吸管，無(wú)菌槍頭，1000μl的移液槍，一次性吸管，中型培養(yǎng)皿以及酒精燈、廢液缸等也需要消毒。

2、加入2—3ml細(xì)胞培養(yǎng)基，即10％FBS（胎牛血清）和DMEM高糖備用。

3.從零下80度的冰箱里取出需要復(fù)蘇的細(xì)胞，放入37℃的水浴中搖晃讓其迅速溶解，細(xì)胞溶解后，將其置于1000r/m的離心機(jī)中離心5分鐘，然后取出。

4.將離心后的細(xì)胞

棄上清，用移液槍取1ml培養(yǎng)基輕輕吹打均勻，取出細(xì)胞勻漿加入到之前加好培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，振蕩均勻，以使細(xì)胞在培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)均勻，吧培養(yǎng)皿在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

5、等到細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)時(shí)取出換液。

二、細(xì)胞換液

所有實(shí)驗(yàn)均需在無(wú)菌環(huán)境下操作。

1.將酒精燈、一次性吸管、廢液缸、鑷子等這些實(shí)驗(yàn)所用到的耗材放入無(wú)菌操作臺(tái)用紫外線進(jìn)行消毒殺菌。

2.將培養(yǎng)的細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。

3.用酒精對(duì)培養(yǎng)皿進(jìn)行消毒，然后將培養(yǎng)皿放入無(wú)菌操作臺(tái)，棄原有的培養(yǎng)基，使用PBS沖洗兩遍。

4.往培養(yǎng)皿中加入新的培養(yǎng)基，用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。

5.往培養(yǎng)箱內(nèi)重新放入換好液的培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)

三、細(xì)胞傳代

在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，當(dāng)細(xì)胞占內(nèi)壁表面80％的比例時(shí)，就需要進(jìn)行

傳代。

1.將實(shí)驗(yàn)所用到的耗材放入無(wú)菌操作臺(tái)用紫外線進(jìn)行半小時(shí)的消毒殺菌。

2.將需要傳代的細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，然后放入無(wú)菌操作臺(tái)，棄原有的培養(yǎng)基，使用PBS沖洗兩遍。

3.加入1ml左右的胰酶對(duì)細(xì)胞消化4分鐘，然后用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。

4.觀察到細(xì)胞從貼壁狀態(tài)變?yōu)閼腋顟B(tài)，且變圓變小

5.加入2倍胰酶的培養(yǎng)基終止消化，用一次性吸管吹打使細(xì)胞全部懸浮。

6.往1500r/m離心管中放入該細(xì)胞懸液，離心5分鐘。

7.從其中一個(gè)離心管中取出細(xì)胞，棄上清，入1ml的培養(yǎng)基吹打均勻，然后加入到全新的已經(jīng)加好培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，振蕩均勻，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

8.對(duì)其他離心管中細(xì)胞進(jìn)行凍存，往其他離心管加入900μl的凍存液（20％FBS），然后避光加入100μl的DMSO（二甲基亞砜）。

9、做好標(biāo)記并用封口膜封好，放入4℃冰箱凍存40分鐘

10、把4℃凍存的細(xì)胞取出放入-20℃冰箱凍存20分鐘，Z后后放入-80℃冰箱長(zhǎng)期保存