在浩瀚無垠的深海中，隱藏著無數(shù)未被發(fā)現(xiàn)的微生物寶藏。這些微小的生命體可能是解決日益嚴重的海洋污染問題的關鍵。傳統(tǒng)方法難以捕捉這些微小生命體，單細胞光鑷拉曼技術可在液體中實現(xiàn)對微生物單細胞的捕獲與操縱，以及拉曼光譜采集、微液滴分離等操作，為深海微生物的免培養(yǎng)原位檢測提供新的思路。

· 光鑷與拉曼光譜技術結合，實現(xiàn)微生物單細胞的液體原位固定與免標記拉曼光譜檢測識別

1、實驗流程

2.1 深海微生物拉曼光譜采集

對深海采集的PE碎片上的微生物混合培養(yǎng)物進行測序，從中選取了5個種屬的細菌單細胞進行拉曼光譜采集，包括不動桿菌（Acinetobacter sp.）、假芽孢菌（Fictibacillus sp.）、鹽單胞菌（Halomonas sp.）、假單胞菌（Pseudomonas sp.）和葡萄球菌（Staphylococcus sp.）。利用光鑷固定微生物單細胞，同時拉曼激發(fā)光用于采集微生物拉曼信號，實現(xiàn)液體中微生物原位拉曼檢測。將每種菌采集的300個光譜求均譜后結果如圖1所示。

2.2 PGGAN算法模擬拉曼光譜

由于海洋微生物密度遠低于富集培養(yǎng)密度，因此為實現(xiàn)更低樣品量下更準確的分類結果，采用了PGGAN算法對采集的拉曼光譜進行模擬，并生成對應的模擬光譜。圖2中藍線為生成光譜的平均光譜，紅線為真實光譜，各菌屬的生成光譜與真實光譜的差異肉眼幾乎無法區(qū)分，說明該方法確實能夠較為真實地模擬各菌屬的拉曼光譜。采用該算法對5種深海微生物各生成了1000個模擬光譜。 

2.3 深度學習對深海菌的預測分類

將上述PGGAN算法生成的每種菌1000個拉曼光譜導入不同的分類模型中（PCA-LDA、PCA-SVM、kNN、CNN、ResNet），對每種菌的光譜數(shù)據取80％用于模型訓練，剩余20％用于預測驗證模型的準確率，得到的最優(yōu)模型ResNet的預測結果如圖3所示，預測的平均準確率為99.8％。

傳統(tǒng)的微生物鑒定方法通常涉及復雜的樣品處理和破壞性，更無法實現(xiàn)原位檢測，限制了對真實樣品的探索。SC-catcher-R單細胞拉曼光鑷操縱與分選系統(tǒng)，集拉曼光譜與光鑷分選于一體，應用光鑷技術在液體中實現(xiàn)對微生物單細胞的捕獲與操縱、單細胞拉曼光譜采集、微液滴分離等操作。在本研究中，運用光鑷-拉曼、PGGAN算法和ResNet分類模型建立了一套用于深海微生物免培養(yǎng)快速原位識別的新方法。該方法減少了對大量樣品數(shù)據的采集需求，解決了低信噪比拉曼光譜的分類難題，為深海微生物的免培養(yǎng)識別提供了一種快速、準確、免標記的檢測工具。

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