超高通量設計，樣本處理效率躍升

HT SpaceM創(chuàng)新工作流程采用了激光刻蝕定制化多孔載玻片，將樣本孔數(shù)量提升至40個，配合可拆卸的細胞制備腔室，經(jīng)過全切片顯微鏡成像與AP-SMALDI5 AF & Q Exactive Plus Orbitrap質(zhì)譜成像分析，結(jié)合細胞分割算法Cellpose和以及跨孔批處理分析，能夠在同一塊載玻片處理高達40個樣品，每個樣品可對超過1000個細胞進行分析，適用于各種細胞類型，大幅降低批次效應，極大地提高了單細胞級別代謝物檢測的通量。

HT SpaceM 工作流程

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標準化數(shù)據(jù)分析框架，數(shù)據(jù)解讀更系統(tǒng)

研究人員提出并驗證了一套單細胞代謝組學數(shù)據(jù)分析框架，該框架整合了質(zhì)量控制、無監(jiān)督聚類、重復性評估、變異性分析、代謝物結(jié)構驗證、富集分析與創(chuàng)新的單細胞共豐度代謝網(wǎng)絡等分析方法。使用該框架，研究者能夠更深入地理解多維度空間代謝組數(shù)據(jù)，識別保守代謝通路、樞紐代謝物以及細胞異質(zhì)性。

HT SpaceM數(shù)據(jù)分析框架

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小分子代謝物高覆蓋、高重現(xiàn)性分析

通過使用高精度的AP-SMALDI5 AF & Q Exactive Plus Orbitrap質(zhì)譜成像平臺，HT SpaceM能夠在單細胞內(nèi)檢測到＞100種小分子代謝物，覆蓋了主要的類別和通路小分子，包括氨基酸、核苷酸、脂肪酸和碳水化合物等。

高靈敏度與高可重復性是新興SCM技術的核心要求。HT SpaceM在孔間與玻片間可重復性高，多數(shù)檢測代謝物變異性低。同一載玻片內(nèi)約76%的玻片內(nèi)孔與孔之間相關系數(shù)（R）≥0.97，不同載玻片的樣本相關性（R）仍高達0.88~0.99，且不受細胞系的影響，81.48%代謝物的CV值≤20%。HT SpaceM檢測結(jié)果通過與常規(guī)液質(zhì)聯(lián)用Orbitrap Exploris 240代謝組學數(shù)據(jù)的對比，驗證了工作流程的準確性。 

解析腫瘤細胞代謝異質(zhì)性

使用HT SpaceM對9種NCI-60腫瘤細胞系（涵蓋乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等）和HeLa細胞進行分析，共檢測到202種小分子離子。單細胞譜圖的 UMAP 顯示，細胞按細胞系清晰聚類，孔重復樣本間可重復性高。進一步通過無監(jiān)督聚類和“一對一”差異分析，揭示細胞系特異性標志代謝物。此外，富集分析可為代謝類別與通路的差異表達提供深入見解，結(jié)合代謝共豐度網(wǎng)絡構建，有助于揭示關鍵代謝樞紐或協(xié)同代謝程序。

藥物干預下的單細胞代謝動態(tài)

為了進一步探究HT SpaceM在藥物研究中的適用性，研究人員對經(jīng)糖酵解抑制劑2-DG處理12h、24h后的HeLa細胞分別進行譜圖分析。HT SpaceM精準捕捉到明顯的代謝變化，且變化符合2-DG的預期效應：葡萄糖積累、糖酵解抑制、檸檬酸水平升高等。單細胞代謝網(wǎng)絡分析顯示，多個通路中代謝協(xié)調(diào)關系發(fā)生改變，藥物處理后以葡萄糖為中心重構代謝網(wǎng)絡。聚類分析識別出三個細胞亞群，表明細胞對處理響應存在異質(zhì)性，為藥物響應差異研究提供新視角。 

HT SpaceM 基于MALDI質(zhì)譜成像系統(tǒng)，解決了此前SCM 面臨的核心痛點，提供高通量、可靠的SCM數(shù)據(jù)，使其特別適用于臨床珍貴的樣本，如循環(huán)腫瘤細胞、免疫細胞或活檢樣本等，為單細胞代謝組學高通量分析提供了全新的技術平臺。

左：AP-SMALDI5 AF Orbitrap質(zhì)譜成像系統(tǒng)

右：Orbitrap Exploris 240高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀

AP-SMALDI Orbitrap質(zhì)譜成像系統(tǒng)除了分析單細胞代謝物空間定位外，還可以作為一種進樣方式，為單細胞代謝組學提供高通量定量分析。本研究采用AP-SMALDI5 AF & Q Exactive Plus Orbitrap質(zhì)譜成像系統(tǒng)，其3μm高空間分辨確?？梢?/span>實現(xiàn)單細胞水平分析，Orbitrap的超高分辨率、超高質(zhì)量精度以及超高靈敏度，確保了低豐度小分子代謝物的可靠檢測，為整個工作流程提供了核心硬件支撐。文中代謝物結(jié)構驗證的LC-MS/MS分析，選用Orbitrap Exploris 240，其24萬分辨率及Compound Discover數(shù)據(jù)庫為代謝物注釋提供了可靠的保障。