導(dǎo)讀

中國疾病預(yù)防控制中心國家病毒病預(yù)防控制研究所和中國首都兒科研究所的科學(xué)家在Canadian Journal of Infectious Diseases and Medical Microbiology上發(fā)表了題為The Viral Load of Human Cytomegalovirus Infection in Children following Hematopoietic Stem Cell Transplant by Chip Digital PCR的文章。文中應(yīng)用naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)建立了芯片數(shù)字PCR（cdPCR）方法，能夠精準(zhǔn)定量HSCT前后兒童HCMV感染的病毒載量。質(zhì)粒pUC57-UL83的cdPCR檢測限為103拷貝/ml，qPCR檢測限為297拷貝/ml。cdPCR檢測HCMV AD169毒株的結(jié)果為146拷貝/ml，表明cdPCR的靈敏度高于qPCR。

人類巨細(xì)胞病毒（HCMV）是一種普遍存在的β-皰疹病毒，已感染發(fā)展中國家高達90%的人口。作為一種常見病原體，HCMV感染在免疫抑制個體中引起了顯著的發(fā)病率和死亡率，特別是在接受了造血干細(xì)胞移植（HSCT）的患者中，原因是原發(fā)感染后潛伏感染的主要靶細(xì)胞是造血細(xì)胞。對于HSCT后的高危兒童，應(yīng)在出現(xiàn)臨床癥狀之前檢測HCMV感染，因為HCMV病毒的載量及變化與HSCT兒童HCMV感染的發(fā)展和嚴(yán)重程度高度相關(guān)。因此，HCMV病毒載量的定量檢測對患兒的治療至關(guān)重要。

應(yīng)用亮點：

?  使用naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)開發(fā)了一種快速、直觀、簡便和準(zhǔn)確的檢測HSCT前后兒童HCMV病毒的絕對定量方法。

? 通過質(zhì)粒和培養(yǎng)毒株驗證naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)靈敏度、特異性和重復(fù)性。

實驗方法：

作者從首都兒科研究所兒童醫(yī)院收集了122名異體造血干細(xì)胞移植患兒、3名自體造血干細(xì)胞移植患兒樣本（男/女:73/52），中位年齡7.5歲。該研究通過質(zhì)粒和培養(yǎng)毒株驗證naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)靈敏度、特異性和重復(fù)性均優(yōu)于qPCR。在HSCT前后，通過qPCR和cdPCR檢測所有供體和受體血清中的HCMV病毒載量。

實驗結(jié)果：

作者通過含有pUC57-UL83基因的質(zhì)粒DNA分別評估cdPCR和qPCR的動態(tài)范圍。cdPCR的檢測限 (LOD) 為103拷貝/ml (2.0拷貝/反應(yīng))，qPCR的LOD為297拷貝/ml。結(jié)果表明，cdPCR的靈敏度高于qPCR。

為了評估cdPCR數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性，作者使用質(zhì)粒建立了HCMV DNA拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。分析cdPCR檢測的變異系數(shù)（CV、標(biāo)準(zhǔn)差/平均值）。結(jié)果表明，cdPCR檢測具有良好的重復(fù)性（CV<15%）。稀釋質(zhì)粒的預(yù)期值與cdPCR檢測值之間也具有良好的一致性（cdPCR檢測值與稀釋質(zhì)粒的預(yù)期值R= 0.979, P< 0.05， qPCR檢測值與稀釋質(zhì)粒的預(yù)期值R= 0.939, P< 0.05）。

▲圖1 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線評估cdPCR檢測的HCMV DNA拷貝數(shù)的變化。黑線顯示質(zhì)粒DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。不同的散點是通過cdPCR測試到的HCMV DNA拷貝數(shù)。

作者又使用HCMV AD169毒株驗證cdPCR的靈敏度。qPCR可以檢測到5.67×10 TCID50/ml HCMV DNA，但不能檢測到5.67 TCID50/ml HCMV DNA。cdPCR可以檢測5.67 TCID50/ml病毒的HCMV DNA。cdPCR的靈敏度優(yōu)于qPCR。

為了驗證cdPCR方法的敏感性以及是否可以用于HSCT患者血液中的HCMV檢測，作者通過qPCR和cdPCR檢測了125例HSCT后兒童的全血樣本。在38份cdPCR陽性樣本中，有4份qPCR陰性樣本。在91份qPCR陰性樣本中，有4份cdPCR陽性。結(jié)果如表1所示。

HCMV在125個HSCT患兒的檢出率為30.40% (38/125)，HCMV病毒載量范圍為107拷貝/ml-6600拷貝/ml。男性組的檢出率為30.14% (22/73)，女性組的檢出率為30.77% (16/52)。在0-12歲HSCT后HCMV陽性兒童中，HCMV的檢出率為89.47% (34/38)。在0-6歲組中，男性的檢出率為25.64% (10/39)，女性的檢出率為22.58% (7/31)。在7-12歲組中，男性的檢出率為39.29% (11/28)，女性的檢出率為40% (6/15)。12歲以上患兒HCMV檢出率為33.33% (4/12)，男性檢出率為16.67% (1/6)，女性檢出率為50% (3/6)。結(jié)果如表3所示。

綜上所述， cdPCR方法在HCMV檢測領(lǐng)域比qPCR更敏感，能快速、直觀、簡便和準(zhǔn)確的檢測HSCT患兒HCMV感染率及病毒載量。

參考文獻：

1.P. Griffiffiffiths, I. Baraniak, and M. Reeves, “,e pathogenesis of human cytomegalovirus,” Journal of Pathology, vol. 235, no. 2, pp. 288–297, 2015.

2.L. Dupont and M. B. Reeves, “Cytomegalovirus latency and reactivation: recent insights into an age old problem,” Reviews in Medical Virology, vol. 26, no. 2, pp. 75–89, 2016.

naica?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司naica?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動化微滴生成和擴增，每個樣本孔可實現(xiàn)6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進行質(zhì)控，3小時內(nèi)即可獲得至少6個靶標(biāo)基因的絕對拷貝數(shù)濃度。