小鼠骨形成蛋白6(BMP-6)ELISA試劑盒實驗使用說明書

　　BS-2274 小鼠骨形成蛋白6(BMP-6)ELISA試劑盒

　　一、實驗原理

　　本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠血清、血漿或細胞培養(yǎng)上清液中的BMP-6濃度。

　　將BMP-6抗體預(yù)包被于微孔板，樣本中的BMP-6與固相抗體結(jié)合

　　加入生物素標記的檢測抗體形成夾心復(fù)合物

　　加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的親和素，徹底洗滌后加入TMB底物顯色

　　顯色深淺與樣本中BMP-6濃度呈正相關(guān)，450nm波長測定吸光度值

　　二、試劑盒組成

　　組分 規(guī)格 保存條件

　　預(yù)包被微孔板 96孔 -20℃干燥保存

　　標準品(凍干) 2瓶 -20℃

　　檢測抗體A(HRP標記) 120μL -20℃

　　檢測抗體B 120μL -20℃

　　標準品稀釋液 20mL 2-8℃

　　洗滌液(30×) 20mL 室溫

　　TMB底物 9mL 2-8℃避光

　　終止液 6mL 室溫

　　注：需自備蒸餾水、酶標儀(450nm濾光片)、微量移液器及吸頭、洗板機/洗瓶

　　三、樣本處理

　　血清樣本?

　　全血室溫靜置30分鐘或4℃過夜后，1000×g離心20分鐘取上清

　　避免反復(fù)凍融，-20℃或-80℃保存

　　血漿樣本?

　　EDTA抗凝，離心條件同上

　　肝素血漿需驗證無干擾

　　細胞上清?

　　1000×g離心10分鐘去除顆粒物

　　樣本稀釋?

　　若濃度超出檢測范圍(0.75-24 ng/mL)，用標準品稀釋液倍比稀釋

　　推薦稀釋比例：1:2、1:4、1:8、1:16

　　四、實驗步驟

　　試劑準備?

　　所有試劑提前20分鐘平衡至室溫(18-25℃)

　　洗滌液配制：20mL濃縮液+580mL蒸餾水(1:29稀釋)

　　標準品梯度：

　　凍干標準品加1mL稀釋液復(fù)溶(10,000pg/mL)

　　倍比稀釋至78pg/mL(共7個濃度點)

　　檢測抗體工作液：

　　檢測溶液A/B各10μL + 990μL對應(yīng)稀釋液(1:100稀釋)

　　加樣?

　　每孔加入100μL標準品/樣本

　　37℃孵育90分鐘

　　洗滌?

　　洗板機洗滌3次，每次浸泡30秒，拍干

　　顯色?

　　每孔加100μL檢測抗體工作液，37℃孵育60分鐘

　　洗滌后加100μL TMB底物，避光顯色15分鐘

　　加50μL終止液終止反應(yīng)(藍色→黃色)

　　檢測?

　　450nm波長測定OD值，酶標儀需提前預(yù)熱

　　五、數(shù)據(jù)分析

　　標準曲線擬合：以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，四參數(shù)邏輯回歸擬合

　　樣本濃度計算：根據(jù)標準曲線插值法計算，乘以稀釋倍數(shù)

　　線性范圍驗證：稀釋回收率應(yīng)在80%-120%之間

　　六、注意事項

　　試劑保存?

　　未開封試劑盒：2-8℃保存6個月

　　開封后：微孔板加干燥劑密封-20℃保存

　　操作規(guī)范?

　　避免液體接觸皮膚，終止液含強酸，操作時戴手套

　　底物避光保存，顯色后30分鐘內(nèi)讀數(shù)

　　加樣順序一致，確保溫育時間相同

　　質(zhì)量控制?

　　板內(nèi)/板間變異系數(shù)<15%

　　空白孔OD值應(yīng)<0.15

　　七、性能參數(shù)

　　檢測范圍：0.75-24 ng/mL

　　靈敏度：<0.1 ng/mL

　　特異性：不與BMP-2/4/7等結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)

　　重復(fù)性：板內(nèi)CV<10%，板間CV<15%

　　注：供科研使用，以上資料供參考，不作為實驗依據(jù)，具體請咨詢技術(shù)老師或品牌商。

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