2025年5月，《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》披露全球首個(gè)個(gè)體化CRISPR基因編輯療法重大突破：研究團(tuán)隊(duì)以“6個(gè)月極速響應(yīng)”，為罹患罕見(jiàn)病——氨基甲酰磷酸合成酶1（CPS1）缺陷癥的9.5個(gè)月大嬰兒完成全流程定制化治療開(kāi)發(fā)。通過(guò)堿基編輯技術(shù)精準(zhǔn)修復(fù)致病突變，患兒血氨水平、體重等關(guān)鍵指標(biāo)顯著改善，標(biāo)志著人類在“單患者基因精準(zhǔn)治療”領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)“從0到1”的歷史性跨越。

罕見(jiàn)病患兒KJ剛出生就確診氨基甲酰磷酸合成酶1（CPS1）缺陷癥，因肝臟無(wú)法正常代謝氨，面臨腦損傷甚至死亡風(fēng)險(xiǎn)，傳統(tǒng)治療需依賴排氮藥物、嚴(yán)格低蛋白飲食及肝移植。研究團(tuán)隊(duì)借助堿基編輯技術(shù)，針對(duì)KJ來(lái)自父母雙方的致病突變，僅用6個(gè)月完成全流程開(kāi)發(fā)，從構(gòu)建攜帶相同突變的小鼠模型與細(xì)胞系、跨物種（猴子）安全性驗(yàn)證，到定制化藥物“k-abe”的生產(chǎn)。2024年2月，KJ接受兩次靜脈注射后，血氨濃度、谷氨酰胺水平等關(guān)鍵生化指標(biāo)顯著改善，體重從同齡嬰兒第9百分位躍升至第26百分位，神經(jīng)系統(tǒng)未受進(jìn)一步損傷且展現(xiàn)正常活力。

這一療法不僅突破了“單患者定制化基因治療”的技術(shù)壁壘，更通過(guò)科研、產(chǎn)業(yè)與醫(yī)療系統(tǒng)的高效協(xié)同，為罕見(jiàn)病治療開(kāi)創(chuàng)了“精準(zhǔn)定制”的全新范式。諾貝爾獎(jiǎng)得主Jennifer Doudna盛贊其為“醫(yī)學(xué)史里程碑”，標(biāo)志著人類正式踏入“可治愈遺傳性疑難雜癥”的新時(shí)代。目前，研究團(tuán)隊(duì)正推動(dòng)“平臺(tái)試驗(yàn)”，旨在針對(duì)同類疾病的多個(gè)突變開(kāi)發(fā)快速編輯方案，讓個(gè)體化治療從“個(gè)案”走向“可復(fù)制模式”。

圖1.全球首個(gè)個(gè)體化CRISPR基因編輯療法重大突破文獻(xiàn)來(lái)源

Cas9 Nuclease來(lái)源于野生型釀膿鏈球菌S. pyogenes，是依賴RNA介導(dǎo)的內(nèi)切核酸酶，可以特異地切割雙鏈DNA（在DNA PAM存在的情況下，也可以切割單鏈DNA或單鏈RNA）。Cas9切割位點(diǎn)位于目標(biāo)序列內(nèi)，離PAM（NGG）區(qū)3個(gè)堿基。本產(chǎn)品經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化及核定位信號(hào)（NLS）設(shè)計(jì)，由大腸桿菌重組表達(dá)而來(lái)，編輯效率高，可用于細(xì)胞（造血干細(xì)胞、T細(xì)胞等）的基因修飾，也可用于分子診斷，檢測(cè)病原體等。

A：體外切割測(cè)試：3批次體外切割活性均達(dá)98%以上。
B：體內(nèi)基因敲除，敲除效率與進(jìn)口品牌一致。

圖2.Cas9 Nuclease體外切割活性及基因敲除效率結(jié)果

Cas12a蛋白

ArCas12a Nuclease (Cat#14702ES)

ArCas12a核酸內(nèi)切酶，源自Agathobacter rectalis細(xì)菌的CRISPR系統(tǒng)，別名Cpf1，是一個(gè)包含1263個(gè)氨基酸的單體蛋白。Cas12a缺乏HNH結(jié)構(gòu)域，可單獨(dú)利用其RuvC結(jié)構(gòu)域在CRISPR RNA（crRNA）引導(dǎo)下識(shí)別位于靶標(biāo)核酸5’端富含胸腺嘧啶（T）的PAM區(qū)而啟動(dòng)對(duì)靶標(biāo)DNA的切割，已成功用于許多哺乳動(dòng)物和植物的基因組編輯。此外Cas12a還具有反式切割活性，可不加選擇地切割反應(yīng)體系中的非靶標(biāo)單鏈DNA。與LbCas12a/AsCas12a相比，ArCas12a具有更高的溫度適應(yīng)性（25-55℃），可適用于基因組編輯及核酸檢測(cè)等。

圖3.ArCas12a順式切割活性檢測(cè) M：Marker；C：模板雙鏈DNA

注：在crRNA的引導(dǎo)下可高效的切割雙鏈DNA（600 bp）產(chǎn)生兩段切割產(chǎn)物（200 bp+400 bp）

圖4.ArCas12a反式切割活性檢測(cè)

注：以雙鏈DNA模板為靶標(biāo)，加入ArCas12a、crRNA（存在與模板DNA序列互補(bǔ)的spacer區(qū)）及單鏈DNA報(bào)告探針（含有熒光報(bào)告基團(tuán)）進(jìn)行體外切割，當(dāng)ArCas12a與crRNA及靶標(biāo)DNA形成復(fù)合體后會(huì)激活反式切割活性，切割單鏈DNA報(bào)告探針，從而發(fā)出熒光。結(jié)果顯示，翌圣ArCas12a與crRNA及模板DNA形成復(fù)合體后具有反式切割活性，可剪切單鏈DNA。

AapCas12b核酸酶（又名C2c1）是由tracrRNA:crRNA（或sgRNA）介導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶，來(lái)源于嗜酸耐熱菌Alicyclobacillus acidophilus，在靶標(biāo)雙鏈DNA存在PAM（TTN）序列的情況下，特異地剪切靶標(biāo)雙鏈DNA，使DNA雙鏈斷裂并生成粘性末端。AapCas12b可不依賴PAM序列特異地剪切單鏈DNA靶標(biāo)。雙鏈或單鏈DNA靶標(biāo)均能激活A(yù)apCas12b的反式剪切活性（即旁路剪切活性/附屬剪切活性），即當(dāng)AapCas12b酶與sgRNA、靶標(biāo)DNA結(jié)合形成三元復(fù)合物后，便會(huì)被激活針對(duì)非特異序列ssDNA的反式剪切活性，將體系中的任意序列ssDNA切碎。AapCas12b最佳剪切反應(yīng)溫度為60℃，比AacCas12b更耐高溫，適用于與LAMP聯(lián)用，開(kāi)發(fā)恒溫?cái)U(kuò)增/CRISPR-Cas檢測(cè)體系。

圖5.AapCas12b Nuclease (10 μM)順式切割活性驗(yàn)證

注：在20 μL的反應(yīng)體系，含有帶PMA序列的雙鏈Target DNA、sgRNA、Cas12b和1×reaction buffer，在60°C下反應(yīng)30 min，85°C下滅活5 min，在瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定結(jié)果顯示，三批次AapCas12b Nuclease (10 μM) (Cat#14808ES)均能有效切割雙鏈Target DNA,切割效果與進(jìn)口品牌T*相當(dāng)。

圖6.AapCas12b Nuclease (10 μM)反式切割活性驗(yàn)證

注：在20 μL的反應(yīng)體系，含有帶PMA序列的雙鏈Target DNA、sgRNA、Cas12b、Report ssDNA熒光探針和1×reaction buffer，在60℃反應(yīng)1h，每30 sec采集一次熒光信號(hào)，結(jié)果顯示在Target DNA、sgRNA、Cas12b共同存在的情況下，Report ssDNA熒光探針能被切割，從而釋放熒光信號(hào)。

該試劑盒的應(yīng)用極為簡(jiǎn)便，用戶只需設(shè)計(jì)一條特定的上游引物，并結(jié)合試劑盒提供的其他試劑，即可在短短4小時(shí)內(nèi)合成出20-100 μg高品質(zhì)的sgRNA。所產(chǎn)生的sgRNA具備高產(chǎn)量、高純度和高活性等優(yōu)勢(shì)，在基因編輯過(guò)程中能顯著提升編輯效率，并大幅降低脫靶現(xiàn)象的發(fā)生幾率，確保基因編輯工作以高效率和高準(zhǔn)確性進(jìn)行。

圖7.不同時(shí)間的sgRNA的合成量

圖8.不同序列的sgRNA的合成產(chǎn)量

圖9.合成的sgRNA的純度（安捷倫2100測(cè)定）

圖10.sgRNA的剪切效率效果圖

當(dāng)前，CRISPR基因編輯技術(shù)正處于快速發(fā)展的時(shí)期，整個(gè)領(lǐng)域仍在不斷成熟和完善中。隨著科學(xué)研究和技術(shù)應(yīng)用的持續(xù)推進(jìn)，我們有理由相信未來(lái)將涌現(xiàn)出更多創(chuàng)新性的基因編輯工具，這些新工具將進(jìn)一步拓寬該技術(shù)的應(yīng)用場(chǎng)景與潛力。

如果您對(duì)基因編輯有任何需求或興趣，歡迎隨時(shí)聯(lián)系我們。無(wú)論是在基礎(chǔ)研究、藥物開(kāi)發(fā)、農(nóng)業(yè)生物技術(shù)、合成生物學(xué)等領(lǐng)域，我們都致力于為您提供最前沿的技術(shù)支持和服務(wù)，共同探索基因編輯帶來(lái)的無(wú)限可能。

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翌圣生物科技（上海）股份有限公司成立于2014年，是一家聚焦生命科學(xué)產(chǎn)業(yè)鏈上游核心原料，從事核苷酸、蛋白、細(xì)胞和類器官四大品類生物試劑的研發(fā)、生產(chǎn)與銷售的高新技術(shù)企業(yè)。公司兼?zhèn)浜诵募夹g(shù)自主研發(fā)和規(guī)?；a(chǎn)能力，核心產(chǎn)品數(shù)量達(dá)數(shù)千種，覆蓋分子克隆、qPCR、NGS、體外轉(zhuǎn)錄、抗體、蛋白純化及分析、細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、報(bào)告基因檢測(cè)和類器官等多種系列，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究、診斷檢測(cè)和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域。