TdT的催化核心由四個結(jié)構(gòu)域組成，整體呈“右手”狀構(gòu)象，與DNA聚合酶β（Pol β）的同源結(jié)構(gòu)域高度相似。其活性中心包含兩個關(guān)鍵基序：ALLGW（T/S）GSR和TGGFRRG。前者通過“打開-關(guān)閉”構(gòu)象轉(zhuǎn)變調(diào)節(jié)底物結(jié)合，后者則依賴精氨酸殘基穩(wěn)定催化反應(yīng)。雙金屬催化機制（通常為Mn2?或Co2?）是TdT的核心特征：金屬A（如Co2?）在底物結(jié)合階段暫時參與，金屬B（如Mg2?）則持續(xù)穩(wěn)定催化中心。這種機制使TdT能高效識別含至少3個堿基的引物鏈，甚至對六乙二醇修飾的短鏈也具有活性。

圖1.TdT催化的反應(yīng)

TdT的底物譜廣泛，涵蓋單鏈DNA（ssDNA）、雙鏈DNA（dsDNA）及部分RNA分子。實驗顯示，其對平末端DNA的催化效率顯著高于模板依賴型聚合酶，且對修飾核苷酸（如ddNTP、DIG-dUTP）具有高度兼容性。典型反應(yīng)條件為37℃、60分鐘，1個活性單位定義為在上述條件下催化1 nmol dNTP摻入DNA的酶量。值得注意的是，高濃度銨根離子、氯離子及EDTA會抑制其活性，而Co2?的添加可提升對平末端的催化效率達(dá)3倍以上。

TdT作為誘變因子參與免疫球蛋白和T細(xì)胞受體蛋白基因多樣性形成，該過程發(fā)生在表達(dá)TdT的前淋巴細(xì)胞，在這些細(xì)胞里TdT隨機添加大約1-10個核苷酸到基因編碼區(qū)末端，從而增加了免疫組庫的多樣性(圖2)。值得注意的是，TdT在V(D)J重組中發(fā)揮作用需要DNA修復(fù)途徑的其他酶(如KU80和XRCC4)協(xié)助，然后被招募到V(D)J重組復(fù)合體。研究表明，敲除TdT基因的小鼠體內(nèi)TCR庫多樣性降低70%，驗證了其在免疫應(yīng)答中的核心作用。

圖2  .TdT的生物學(xué)功能

TdT在基因工程中的經(jīng)典應(yīng)用是“同聚物加尾法”。通過在載體DNA的3'末端添加dATP或dTTP尾鏈，與互補的外源DNA片段退火連接，可高效構(gòu)建重組質(zhì)粒。例如，在cDNA文庫構(gòu)建中，TdT介導(dǎo)的加尾反應(yīng)使mRNA的3'末端獲得poly（A）尾鏈，從而與含poly（T）的載體特異性結(jié)合，提升克隆效率。此外，在RACE（快速擴增cDNA末端）技術(shù)中，TdT通過添加隨機核苷酸尾鏈，為后續(xù)PCR提供引物結(jié)合位點，實現(xiàn)全長cDNA的捕獲。

圖3 .使用TdT合成DNA

細(xì)胞凋亡發(fā)生時，相關(guān)DNA內(nèi)切酶會被激活，從而切斷核小體間的DNA。在細(xì)胞凋亡晚期，DNA會被降解為180-200 bp的片段。 TdT介導(dǎo)的dUTP末端標(biāo)記法（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL）是在TdT的催化下將熒光素標(biāo)記的dUTP（fluorescein-dUTP）與斷裂DNA暴露的3'-OH聚合，延伸后的DNA可通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進行檢測。臨床研究顯示，TUNEL在急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）診斷中具有特異性。ALL患者骨髓樣本的TdT陽性率達(dá)95%，而成熟淋巴細(xì)胞呈陰性，為疾病分型和預(yù)后評估提供關(guān)鍵依據(jù)。

圖4 .TdT標(biāo)記細(xì)胞凋亡

在全基因組亞硫酸氫鹽測序（WGBS）中，TdT通過添加同聚物尾鏈實現(xiàn)ssDNA與接頭的連接。具體流程為：

圖5. DNA甲基化建庫流程

TdT在DNA從頭合成技術(shù)中占據(jù)核心地位?；谄浞悄０逡蕾囂匦?，研究者開發(fā)出兩種策略：

TdT酶（末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶）在DNA微陣列技術(shù)中主要應(yīng)用于單鏈DNA文庫構(gòu)建及探針標(biāo)記優(yōu)化，通過其非模板依賴的末端延伸特性提升雜交效率與信號強度，同時助力DNA序列的定向修飾，為微陣列檢測的靈敏度和特異性提供關(guān)鍵支持。

TdT作為分子生物學(xué)工具中的“非模板革命者”，其應(yīng)用已從基因工程基礎(chǔ)技術(shù)延伸至臨床診斷和合成生物學(xué)前沿。隨著酶工程改造技術(shù)的進步，TdT的穩(wěn)定性、底物兼容性和催化效率將持續(xù)優(yōu)化，為DNA測序、疾病標(biāo)志物開發(fā)及DNA存儲技術(shù)提供更強動力。未來，TdT有望成為連接基礎(chǔ)研究與臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵橋梁，推動生命科學(xué)進入精準(zhǔn)調(diào)控的新紀(jì)元。

現(xiàn)在翌圣重磅推出具有低殘留、高純度的特點的TdT末端轉(zhuǎn)移酶，高效進行DNA末端的同聚物加尾。適用于各種應(yīng)用場景。

切口酶殘留結(jié)果：跑膠結(jié)果顯示兩批次TdT末端轉(zhuǎn)移酶與陰性對照（C）一致，顯示無切口酶殘留。

核酸外切酶殘留結(jié)果：跑膠結(jié)果顯示兩批次TdT末端轉(zhuǎn)移酶與陰性對照（C）一致，顯示無核酸外切酶酶殘留。

參考文獻：

Chengjie Zhang, et,al.Terminal deoxynucleotidyl transferase: Properties and applications,Engineering Microbiology , Volume 5, Issue 1 , 2025,100179, ISSN 2667-3703.

#Terminal Deoxynucleotidyl Transferase  #TdT #末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶

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