我國不孕不育率逐年攀升，根據(jù)《柳葉刀中國婦幼健康特邀 重大報(bào)告》預(yù)測數(shù)據(jù)，2023年我國不孕率18.2% ，預(yù)計(jì)2025年將接近20%。不孕不育率的快速上升意味著輔助生殖服務(wù)潛在需求人數(shù) 增長，從而驅(qū)動輔助生殖市場擴(kuò)容。輔助生殖（ART）由三種手段組成：人工授精、配子移植技術(shù)、體外受精-胚胎移植（IVF-EF）。其中體外受精-胚胎移植即試管嬰兒，是指將不孕夫婦的卵子和精子通過人工方式取出，在體外培育受精并完成早期胚胎發(fā)育后，再移植回母體子宮內(nèi)實(shí)現(xiàn)妊娠。

圖1.輔助生殖診療過程（來源：艾瑞咨詢）

中國每年新增出生缺陷兒約90萬例，其中單基因遺傳病占比高達(dá)22.2%。隨著基因檢測技術(shù)的突破，PGT（胚胎植入前遺傳學(xué)檢測）技術(shù)為這些家庭提供了從源頭阻斷遺傳病的新選擇。迄今為止，全球已經(jīng)有數(shù)萬例家庭通過試管技術(shù)助孕，順利圓夢→獲得健康寶寶!誠然一個(gè)個(gè)試管寶貝的誕生也見證了輔助生殖技術(shù)從無到有，從有到優(yōu)的過程；該技術(shù)的不斷更新升級更幫助人們有效解決“生不出”難題，且致力于化解“生不好”的困擾。

第三代試管嬰兒即胚胎植入前遺傳學(xué)篩查診斷技術(shù)(PGS/PGD)，主要是對胚胎的遺傳物質(zhì)進(jìn)行檢測。PGS即胚胎植入前遺傳學(xué)篩查，是對胚胎的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測，分析對比是否有重復(fù)、缺失或易位等異常情況；PGD即胚胎植入前遺傳學(xué)診斷，是對染色體上的基因進(jìn)行檢測，診斷胚胎有沒有攜帶導(dǎo)致某種特定疾病的基因突變。

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的定義，PGD\PGS有了新的命名，統(tǒng)一稱PGT，包括PGT-A,PGT-M,PGT-SR；PGT技術(shù)通過在體外受精后對胚胎進(jìn)行基因檢測，篩選出無遺傳缺陷的胚胎進(jìn)行移植，將遺傳病防控從產(chǎn)前診斷提前至胚胎階段。這一技術(shù)被譽(yù)為“第三代試管嬰兒”。

圖2.PGT的工作流程

表1.PGT的分類

利用單細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)和NGS技術(shù)對輔助生殖過程中體外培養(yǎng)的卵裂期或囊胚期胚胎進(jìn)行檢測，既單細(xì)胞測序全基因組擴(kuò)增（WGA），該技術(shù)可檢測全部的23對染色體非整倍體、≥4Mb的染色體片段缺失和重復(fù)、≥10Mb且比例≥30%的嵌合和夫婦一方或雙方已知1-4 Mb遺傳型CNVs。測序數(shù)據(jù)量1-2 M左右。

目前存在的主要三種擴(kuò)增方法有：簡并寡核苷酸引物PCR擴(kuò)增（DOP-PCR）、多重置換擴(kuò)增（MDA）、多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增（MALBAC），三種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。

表2.單細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)的三種方法對比

采用隨機(jī)引物或者部分隨機(jī)引物，通過熱循環(huán)實(shí)現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增，具體來說DOC-PCR（Degenerate Oligonucleotide Primed PCR），即退化寡核苷酸引物PCR，是隨機(jī)擴(kuò)增得到全基因組序列的；這不同于一般的PCR，一般的PCR只能擴(kuò)增特定的DNA片段。該技術(shù)需要使用簡并配對引物，即類脫氧肌苷引物，它可以結(jié)合到DNA任何部位。引物的3’端為6bp退化寡核苷酸，5’端為正常的堿基。3’端和DNA鏈隨機(jī)結(jié)合，最初幾個(gè)循環(huán)退火溫度要低（30℃左右），然后延伸直到5’端引物配對處。但該技術(shù)容易造成堿基對突變、短串聯(lián)重復(fù)( short tandem repeat，STR)增加或減少。

圖3.DOP-PCR原理

技術(shù)原理：擬線性的擴(kuò)增過程降低了指數(shù)擴(kuò)增的序列偏好性。擴(kuò)增引物，5’含有27 bp的共同序列，3’是8 bp的隨機(jī)序列。利用特殊的隨機(jī)引物，使擴(kuò)增產(chǎn)物能首尾互補(bǔ)形成環(huán)，進(jìn)行近乎線性的全基因組預(yù)擴(kuò)增，再通過PCR技術(shù)進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增，從而降低擴(kuò)增過程中錯(cuò)誤累積。擴(kuò)增偏好性可重復(fù)，適合CNV檢測；聚合酶保真性一般，不適合SNV檢測。

圖4.MALBAC原理圖

采用隨機(jī)6堿基引物，在恒溫條件下，由Phi29 DNA聚合酶引導(dǎo)，與模板DNA結(jié)合，進(jìn)而置換模板的互補(bǔ)鏈，而后循環(huán)擴(kuò)增。Phi29 DNA聚合酶相對傳統(tǒng)的DNA聚合酶具備更高的擴(kuò)增效率和保真性。具體來說MDA擴(kuò)增原理是使用隨機(jī)的六聚體引物和phi29DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增。該聚合酶具有很強(qiáng)的鏈置換特性，可擴(kuò)增產(chǎn)生50~200 kb的DNA片段，可用于構(gòu)建大片段文庫，同時(shí)該酶還能以新合成的DNA子鏈為模板，繼續(xù)合成新的DNA子鏈，擴(kuò)增產(chǎn)量高，同時(shí)由于其3’-5’核酸外切酶活性和校對活性，phi29 DNA聚合酶具有很高的復(fù)制保真性，準(zhǔn)確性更高、基因組覆蓋度更高，適用于SNV分析。雖然產(chǎn)物產(chǎn)量高和擴(kuò)增產(chǎn)物長度可達(dá)100 Kb左右，覆蓋度好，但是對樣本質(zhì)量要求高且指數(shù)擴(kuò)增的偏好性重復(fù)性不好，不適合CNV類檢測。

圖5.MDA單細(xì)胞基因組測序流程

翌圣生物科技（上海）股份有限公司成立于2014年，是一家聚焦生命科學(xué)產(chǎn)業(yè)鏈上游核心原料，從事核苷酸、蛋白、細(xì)胞和類器官四大品類生物試劑的研發(fā)、生產(chǎn)與銷售的高新技術(shù)企業(yè)。公司兼?zhèn)浜诵募夹g(shù)自主研發(fā)和規(guī)?；a(chǎn)能力，核心產(chǎn)品數(shù)量達(dá)數(shù)千種，覆蓋分子克隆、qPCR、NGS、體外轉(zhuǎn)錄、抗體、蛋白純化及分析、細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、報(bào)告基因檢測和類器官等多種系列，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究、診斷檢測和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域。