熒光定量PCR是實驗室中出鏡率非常高的一種技術(shù)手段。它通過在PCR體系中添加熒光基團(tuán)來顯示DNA產(chǎn)物的累積情況，從而達(dá)到對PCR過程進(jìn)行實時監(jiān)控的目的。并且可以通過數(shù)據(jù)分析計算出起始模板量，這就是“熒光定量”中“定量”一詞的來源。

熒光定量PCR實驗因為靈敏度高所以經(jīng)常是差之毫厘謬以千里，所以在實驗過程中，我們需要注意諸多細(xì)節(jié)，謹(jǐn)慎操作。小伙伴們看到這里就要著急了，我怎樣才能做好qPCR實驗，拿到實驗結(jié)果，發(fā)表高分文章，走上人生巔峰呢？

 

引物設(shè)計的好壞，關(guān)乎著擴(kuò)增效率的高低、產(chǎn)物特異性的與否。所以正確設(shè)計出引物是qPCR成功的第一步。

首先，我們知道qPCR是特殊的PCR，所以，qPCR的引物設(shè)計要滿足一般PCR引物設(shè)計的原則，見下表。

 

 

除此之外，qPCR引物設(shè)計需要額外注意幾點(diǎn)。

1. 擴(kuò)增片段長度：

擴(kuò)增效率隨著擴(kuò)增子長度減小而增大，建議擴(kuò)增產(chǎn)物最好在80-200bp的范圍，若產(chǎn)物小于75bp，擴(kuò)增子很難與引物二聚體區(qū)分開，若產(chǎn)物大于300bp，則會因為酶活降低導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低。如果你的擴(kuò)增產(chǎn)物因為實驗需求一定要在500-600bp的話，做qPCR實驗時要選用三步法擴(kuò)增，不要用快速兩步法擴(kuò)增。

2. 區(qū)分isoform：

對于同一個基因名來說，可能會有不同的isoform。isoform指的是，對于同一個基因，它的mRNA有多種不同剪接方式，這個時候表達(dá)出來的的蛋白可能會有不同，所以小伙伴們在設(shè)計實驗的時候，一定要想清楚自己要做的是哪一個isoform。

舉個“栗子”：比如說一個基因有四種不同的isoform，如果大家想要檢測的是四種不同剪接方式轉(zhuǎn)錄本之和，那么設(shè)計引物時就要針對這四個isoform的共有序列設(shè)計。如果只想檢測其中一種isoform，那就要在這個isoform與其他三個isoform的不同序列位置設(shè)計引物。

3. 跨內(nèi)含子設(shè)計引物：

跨越內(nèi)含子設(shè)計引物可以區(qū)分并且規(guī)避基因組DNA污染。設(shè)計引物時需要讓一端或兩端引物跨越內(nèi)含子，以人基因組來說，平均每個基因有8.8個外顯子和7.8個內(nèi)含子，80%的外顯子長度小于200bp，少于10%的內(nèi)含子長度在1100bp以上，不到0.01%的內(nèi)含子長度小于20bp。（Sakharkar MK et al. Distributions of exons and introns in the human genome[J].In Silico Biol. 2004;4(4):387-93.）例如外顯子長度200bp，為了兼顧擴(kuò)增子長度，我們可以把上游引物設(shè)置在外顯子1和外顯子2的中間，下游引物設(shè)置在外顯子2的位置（如下圖所示）。

 

 

 

好啦，以上是引物設(shè)計需要注意的問題，在設(shè)計好引物之后，我們需要在NCBI上進(jìn)行BLAST檢驗，來確保產(chǎn)物的特異性。

理論知識很豐富了，現(xiàn)在讓我們實戰(zhàn)一下吧！
 

第一步：選擇靶基因

打開NCBI，選擇“Gene”，輸入想要檢測的基因名稱，我們以人基因“ALAD”為例。

 

 

會出現(xiàn)很多搜索結(jié)果，我們選擇需要的種屬來源，即“human”，如果你知道Gene ID（每個基因有且只有一個特定的ID，類似于人的身份證），也可以根據(jù)Gene ID來選擇。這里我們選擇搜索結(jié)果中的第一個。

 

    

 

點(diǎn)開之后，會出現(xiàn)很長的頁面，耐心往下拉，找到“mRNA and Protein（s）”欄下的NM編號，不同的NM編號，代表不同的isoform。選擇想要檢測的那一個。
 

 

 

確定NM號點(diǎn)擊后，可以看到這個isoform的一些基本信息。

例如：      

以及此基因的序列，如下圖所示。此序列就是設(shè)計引物時對應(yīng)的模板。

 

 

例如：       

 

 

 

第二步：用軟件設(shè)計引物

引物設(shè)計軟件有很多，例如oligo7、Primer5、Clone Manager等，以及很多在線網(wǎng)站，例如Primerbank （https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/）、

Primer3plus（http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi） 、

NCBI 的Primer BLAST等。在手頭沒有安裝合適的軟件的時候，我們可以選擇在線網(wǎng)站設(shè)計引物。

小翌以NCBI網(wǎng)站里的Primer BLAST為例講解。

 

打開NCBI,在頁面底端有Primer BLAST。

點(diǎn)擊Primer BLAST后，在彈出來的界面里粘貼模板序列或者輸入基因序列號。另外需要設(shè)置“上下游引物位置”和“擴(kuò)增子長度”。主要的設(shè)置就是這兩點(diǎn)了，另外還有“物種名稱”、“數(shù)據(jù)庫”等其他選項可以設(shè)置。

設(shè)置好之后，點(diǎn)擊頁面左下角的“get Primer”

彈出如下界面，點(diǎn)擊“Check”

出現(xiàn)多對引物，選擇合適的引物即可。

 

 

 

 

 

 

第三步：BLAST檢驗

在NCBI主頁的右邊找到BLAST入口。

點(diǎn)擊后，選擇“Nucleotide BLAST”。

在界面里輸入引物序列，選擇對應(yīng)數(shù)據(jù)庫。進(jìn)行BLAST。

 

以上是對qPCR引物設(shè)計的介紹，相信小伙伴們通過小翌的介紹，對如何設(shè)計引物已經(jīng)有一定的了解啦。