PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是利用DNA在體外攝氏95°高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60°C左右）時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶Z適反應(yīng)溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈?；诰酆厦钢圃斓腜CR儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設(shè)備，能在變性溫度，復(fù)性溫度，延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。下面就讓小編帶你了解一下PCR引物設(shè)計(jì)的目的和原則。

引物設(shè)計(jì)的目的

為了找到一對(duì)合適的核苷酸片段，從而能夠?qū)δ０錎NA序列進(jìn)行有效地?cái)U(kuò)增。

引物設(shè)計(jì)的重要原則

使得特異性和擴(kuò)增效率Zda限度地提高，同時(shí)使得非特異性擴(kuò)增盡可能的減少。

引物設(shè)計(jì)的基本原則

1.不能修飾引物的3′端，可以修飾引物的5′端

PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度取決于引物的5′端，擴(kuò)增的特異性不太受到引物的5′端的影響，引物的5′端能夠被修飾但不對(duì)擴(kuò)增的特異性產(chǎn)生影響。

因?yàn)檠由焓且?′端為起點(diǎn)的，因此，3′端不可以進(jìn)行任何修飾。

2.互補(bǔ)序列不應(yīng)該存在于引物自身和引物之間

不能有3個(gè)以上的引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基，不能有4個(gè)以上的引物之間連續(xù)互補(bǔ)堿基，特別需要防止3′端的互補(bǔ)重疊。

3.引物中四種堿基Z好隨機(jī)分布

避免連續(xù)的3個(gè)G或者C出現(xiàn)在引物的3′端，防止在G+C富集序列區(qū)域引物產(chǎn)生錯(cuò)配，從而使得擴(kuò)增的特異性降低。

4.Z佳退火溫度為55-60攝氏度，Tm差值應(yīng)低于1攝氏度

通常情況下，PCR的Z適退火溫度要低于引物Tm值5攝氏度左右，若一對(duì)引物的Tm差值過(guò)大，那么會(huì)直接造成PCR失敗或者擴(kuò)增效率下降。

5、通常情況下，G+C含量為40％-60％

引物的解鏈溫度會(huì)受到引物的堿基組成的影響。若G+C含量過(guò)高，那么解鏈溫度高，容易和非特異性序列雜交，使得非特異性擴(kuò)增條帶出現(xiàn)。若G+C含量過(guò)低，那么解鏈溫度低，容易使得引物從模板上解離。

6.通常情況下，引物的長(zhǎng)度為18-30堿基

解鏈溫度和反應(yīng)的特異性與引物長(zhǎng)度成正相關(guān)。若引物過(guò)長(zhǎng)，則會(huì)使得引物二級(jí)結(jié)構(gòu)以及引物二聚體產(chǎn)生；若引物過(guò)短，則會(huì)降低擴(kuò)增的特異性。

7.對(duì)容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板序列區(qū)域避開(kāi)

二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)使得PCR和引物與模板雜交變得更加困難，所以，對(duì)這種序列區(qū)域要盡可能避開(kāi)?？梢允褂孟嚓P(guān)軟件對(duì)mRNA的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

8.引物的特異性要足夠

若特異的DNA序列需要從基因組等比較復(fù)雜的模板中被擴(kuò)增，那么需要對(duì)目的DNA序列的保守性進(jìn)行考慮，對(duì)于所選引物設(shè)計(jì)區(qū)域序列的非特異性要盡量避免。