精準檢測，至關重要

RNA病毒的宿主眾多，涵蓋幾乎所有類型的生命體。很多RNA病毒讓宿主們談虎色變，具有非常強的侵略能力，會嚴重影響宿主生命活動。我們常聽到的RNA病毒均臭名昭著之輩，如艾滋病病毒、流感病毒、登革熱病毒、煙草花葉病毒、噬菌體等。 

我們以HIV病毒急性感染期感染過程，可以看下HIV病毒精準檢測對于診斷和治療效果評估的重要性。

HIV急性感染期可分為病毒感染期、隱蔽期及病毒血癥峰，是病毒檢測的重要時期。

新英格蘭雜志進行過一項急性感染期的前瞻性研究，研究表明1.94%的急性HIV-1感染隨訪者出現(xiàn)臨床癥狀或體征；其中發(fā)熱、頭痛、周身不適等臨床癥狀大多出現(xiàn)在病毒血癥峰高峰前，心動過速、淋巴結腫大、頭頸部異常等體征大多出現(xiàn)在病毒血癥峰高峰時?？梢娙绻ㄟ^癥狀和體征來判斷病毒感染情況，必然是錯過了最佳的治療期，因為此時病毒已經產生了一定量的復制。因此在最早期階段，高靈敏地檢測出病毒，甚至精準地確認病毒的拷貝數(shù)，就可以為最大程度的控制病毒復制提供重要參考。

如何精準地檢測到病毒呢（定性）？是否可以有效判定出有多少個病毒呢（定量）？

我們以登革熱病毒的檢測為例，來了解一步法RT-qPCR Probe技術。 
 

一步法RT-qPCR Probe技術介紹

一步法RT-qPCR（One-Step reverse transcription-quantitative PCR）用于以RNA為起始模板的定性和定量分析，將RNA逆轉錄合成cDNA的過程與靶標基因的PCR擴增于一管內依次進行。利用熒光標記的Probe來監(jiān)控PCR擴增產物的變化，進而判斷RNA初始量的技術叫做一步法RT-qPCR Probe技術。探針是一類熒光分子標記的寡核苷酸序列，根據(jù)堿基互補配對原則與PCR擴增產物結合，合理的設計可分辨出單個堿基變異。

1、登革熱病毒的基因分型檢測

登革熱病毒是RNA病毒，分為1-4型血清型，Den-1、Den-2、Den-3和Den-4，不同血清型會引起不同嚴重程度的疾病【1、2】，嚴重者致出血致死。因此，有效區(qū)分血清型非常必要。

當前主要檢測技術包括檢測血液中病毒核酸的分子診斷技術和測定中和抗體，前者是當前唯一能夠判定病毒血清型的方法。而基于核酸的分子診斷技術中，One Step RT-qPCR技術因檢測耗時短，工作量較小，結果可靠，且能夠對樣本病毒載量進行定量，而占據(jù)主導地位。

第一步：快速判定是否是登革熱病毒感染：

One Step RT-qPCR Probe檢測思路【3】：選取四種血清型共有的保守區(qū)域，因四種血清型的探針結合區(qū)域（保守區(qū)域）有1個堿基不同，可設計兩類Taqman探針，5’端用6-FAM熒光基團標記的taqman探針檢測Den-1和Den-3（黑色線條），5’端用JOE熒光基團標記的taqman探針檢測Den-2和Den-4（綠色線條）。也即是多重實時PCR。

第二步：確認為登革熱病毒感染后，區(qū)分感染的血清型：

One Step RT-qPCR Probe檢測思路：比對Den-1型、Den-2型、Den-3型、Den-4型序列，篩選出各自的保守區(qū)序列，用以設計引物和探針。

2、登革熱病毒的個數(shù)檢測

以已知數(shù)量的噬菌斑形成單位的登革熱病毒分離株梯度稀釋，以提取得到的RNA作為標準品，進行一步法RT-qPCR實驗，制作標準曲線。之后根據(jù)待測血清中得到的Ct值，判定病毒的噬菌斑形成單位數(shù)。

3、登革熱病毒檢測時，幾種基于核酸的分子診斷技術的比較

至今，最初的RT-PCR漸日落西山，處于成熟期的RT-qPCR風頭正盛，日益崛起的數(shù)字PCR大有可期。RNA病毒的分子檢測技術可謂革新不斷。一步法RT-qPCR Probe技術無需開管即保證了qPCR對產物的實時監(jiān)控和產物分析，最大程度的避免了污染（相對于RT-PCR），同時，具備更高樣本檢測通量（相對于二步法RT-qPCR）。

總結
 

病原體（病毒）的精準檢測對于疾病的篩查及治療效果評估非常重要，借助分子生物學技術可以精準檢測病原體（病毒），其中的一步法RT-qPCR技術可被廣泛用于RNA病毒類型判定、病毒亞型判定、病毒定量及病毒突變體等方面，廣泛用于食品安全、動物疫病、疾病診斷與治療效果評估等臨床與公共衛(wèi)生等領域。

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文獻

[1] Burke DS, Nisalak A, et al. A prospective study of dengue infections in Bangkok. Am J Trop Med Hyg. 1988 Jan;38(1):172-80.

[2] Eili Huhtamo, et al. Molecular Epidemiology of Dengue Virus Strains from Finnish Travelers. Emerg Infect Dis. 2008 Jan; 14(1): 80–83. 

[3] Callahan JD, Wu SJ, Dion-Schultz A , et al. Development and evaluation of serotype- and group-specific fluorogenic reverse transcriptase PCR (TaqMan) assays for dengue virus. J Clin Microbiol. 2001 Nov;39(11):4119-24.