人抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)ELISA試劑盒的實(shí)驗(yàn)使用說(shuō)明書如下：

　　一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

　　本試劑盒用于檢測(cè)人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中人抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)水平。

　　二、實(shí)驗(yàn)原理

　　本試劑盒采用雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定標(biāo)本中人抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)。用純化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，可與樣品中抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)相結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后再與HRP標(biāo)記的抗原結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物。經(jīng)過(guò)洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成的黃色。顏色的深淺和樣品中pANCA的含量呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，與CUTOFF值相比較，從而判定標(biāo)本中人抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)的存在與否。

　　三、樣本處理

　　?血清?：室溫血液自然凝固10~20分鐘，離心20分鐘左右(2000~3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

　　?血漿?：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10~20分鐘后，離心20分鐘左右(2000~3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。

　　?尿液?：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右(2000~3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。

　　?細(xì)胞培養(yǎng)上清?：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右(2000~3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS(PH7.2~7.4)稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000~3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

　　?組織標(biāo)本?：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2~8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4)，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000~3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。

　　四、實(shí)驗(yàn)步驟

　　?編號(hào)?：將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照2孔、陽(yáng)性對(duì)照2孔、空白對(duì)照1孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)。

　　?加樣?：分別在陰、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照50μl。然后在待測(cè)樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl。

　　?溫育?：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

　　?配液?：將30倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用。

　　?洗滌?：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

　　?加酶?：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

　　?溫育?：操作同3。

　　?洗滌?：操作同5。

　　?顯色?：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。

　　?終止?：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。

　　?測(cè)定?：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

　　五、結(jié)果判定

　　?試驗(yàn)有效性?：陽(yáng)性對(duì)照孔平均值≥1.00;陰性對(duì)照平均值≤0.10。

　　?臨界值(CUT OFF)計(jì)算?：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15。

　　?陰性判定?：樣品OD值<臨界值(CUT OFF)者為抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)陰性。

　　?陽(yáng)性判定?：樣品OD值≥臨界值(CUT OFF)者為抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)陽(yáng)性。

　　六、注意事項(xiàng)

　　操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行，本試劑不同批號(hào)組分不得混用。

　　試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15~30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

　　濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

　　底物請(qǐng)避光保存。

　　試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，使用雙波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，參考波長(zhǎng)為630nm。

　　所有樣品、洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為2M的硫酸，使用時(shí)必須注意安全。

　　七、保存條件與有效期

　　?保存條件?：2~8℃低溫冷藏。

　　?有效期?：6個(gè)月。

　　請(qǐng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。