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將傳感裝置集成到細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中是實時研究病理學(xué)和復(fù)雜生物機(jī)制的一個熱門話題。特別是被稱為器官芯片（Organ-on-Chip，OoC）的專用微流控裝置，其承載著模擬體內(nèi)環(huán)境的活體工程器官，從傳感器的集成中獲益良多，這使得能夠監(jiān)測與生物過程相關(guān)的特定化學(xué)物理參數(shù)。在此背景下，銅是一種必需的微量元素，其總濃度可能與特定疾病相關(guān)，因此在細(xì)胞系統(tǒng)中開發(fā)可靠的分析技術(shù)至關(guān)重要。銅可以通過陽極溶出伏安法（ASV）技術(shù)測定，但其在細(xì)胞培養(yǎng)基中的應(yīng)用存在諸多挑戰(zhàn)。因此，在這項工作中，評估了 ASV 在細(xì)胞培養(yǎng)基中的性能，并測試了一種酸化方案以提高伏安信號強(qiáng)度。使用 Transwell? 培養(yǎng)模型和 CaCO2 細(xì)胞進(jìn)行離線測量，以測試所開發(fā)的酸化方案在細(xì)胞培養(yǎng)基中的適用性。最后，設(shè)計了一種微流控裝置，以實現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)基酸化的自動化操作，并將其與硅微電極集成，以進(jìn)行原位測量。由此產(chǎn)生的傳感器集成微流控芯片可用于監(jiān)測器官芯片模型中銅或其他離子的濃度；這些功能為在接近體內(nèi)條件下對生物系統(tǒng)進(jìn)行非破壞性戰(zhàn)略實驗提供了巨大機(jī)會。

體外模型在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域是一種非常重要的研究工具，因為它們能夠揭示細(xì)胞的行為，并可用于研究病理學(xué)和復(fù)雜的生物機(jī)制。特別是器官芯片（OoC）代表了體外系統(tǒng)的最新發(fā)展，其中細(xì)胞在具有傳感功能的微流控芯片中培養(yǎng)，以模擬器官的功能和（病理）生理反應(yīng)，并監(jiān)測特定的化學(xué)物理參數(shù)。微量營養(yǎng)素，如過渡金屬離子鋅、銅和鐵，對生命至關(guān)重要，因為它們是多種蛋白質(zhì)和酶的輔助因子；另一方面，金屬過量會導(dǎo)致自由基的形成，從而在體內(nèi)引發(fā)毒性。因此，所有生物都發(fā)展出了復(fù)雜的機(jī)制來精細(xì)調(diào)節(jié)離子水平，以確保細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的穩(wěn)態(tài)。旨在提供生理相關(guān)結(jié)果的微生理平臺，若能采用快速且原位的技術(shù)來測量微量營養(yǎng)素的濃度，同時模擬生物系統(tǒng)，將會受益匪淺。

銅是一種對我們的生存至關(guān)重要的微量礦物質(zhì)，存在于人體的所有組織中。銅在紅細(xì)胞生成、神經(jīng)細(xì)胞和免疫系統(tǒng)的維持方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用；它對膠原蛋白的形成和能量的產(chǎn)生也很重要。銅含量失衡可能與某些疾病有關(guān)，如門克斯病、威爾遜病和阿爾茨海默??；此外，銅含量過低還可能導(dǎo)致心血管疾病。銅從飲食中吸收，其在腸道中的管理和調(diào)節(jié)對于維持全身銅的平衡至關(guān)重要。

飲食中的銅主要以 Cu2+ 的形式存在，會被還原（可能以 Cu+ 的形式），然后被腸上皮細(xì)胞吸收。最近的證據(jù)表明，具有兩個銅結(jié)合位點（一個結(jié)合 Cu2+，一個結(jié)合 Cu+）的腸黏蛋白糖蛋白參與保護(hù)細(xì)胞免受過量銅毒性的侵害，通過阻止不必要的氧化還原循環(huán)并控制生理過程所需的低水平銅攝取。盡管腸道銅吸收的調(diào)節(jié)至關(guān)重要，但目前對其涉及的機(jī)制了解甚少。因此，對細(xì)胞培養(yǎng)基中 Cu2+ 濃度進(jìn)行實時監(jiān)測可能是研究銅轉(zhuǎn)運和攝取過程的重要工具。

測定銅的典型分析技術(shù)有原子吸收光譜法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法和電感耦合等離子體質(zhì)譜法。這些分析技術(shù)非常靈敏，但需要使用笨重且昂貴的儀器設(shè)備。此外，這些技術(shù)需要一個重要的準(zhǔn)備階段，使用強(qiáng)酸性物質(zhì)、高溫和/或高壓。作為替代方案，光學(xué)方法具有高度靈敏、選擇性好、成本低且易于應(yīng)用的優(yōu)點。在這些系統(tǒng)中，識別元件（光學(xué)探針）與目標(biāo)物質(zhì)之間的相互作用可以引起光學(xué)特性的變化。有時，光學(xué)探針與目標(biāo)分析物之間的相互作用可能會導(dǎo)致有毒物質(zhì)的形成，當(dāng)在細(xì)胞環(huán)境中進(jìn)行檢測時，這一點必須深入評估。此外，在細(xì)胞培養(yǎng)基等復(fù)雜介質(zhì)中使用光學(xué)方法時，其他有機(jī)物質(zhì)的存在可能會干擾光學(xué)活性物質(zhì)的形成。由于這些原因，使用光學(xué)方法并非總是最佳選擇。

在這種情況下，電化學(xué)方法成本低、操作簡便且速度快，因此適用于原位和在線分析。特別是陽極溶出伏安法（ASV）是一種檢測包括銅在內(nèi)的重金屬的非常通用的技術(shù)。這種分析技術(shù)基于兩步檢測。第一步是在工作電極表面通過施加負(fù)電位（根據(jù)Pourbaix圖）將銅離子沉積/還原。在第二步中，從沉積時的電位開始進(jìn)行電位掃描，直至電位足以使離子再次被氧化并從工作電極表面“溶出”。溶出過程對應(yīng)于伏安圖中出現(xiàn)的峰，其電流強(qiáng)度與離子濃度成正比（定量分析），而峰電位則特定于被分析物（定性分析）。

在細(xì)胞培養(yǎng)基中，電化學(xué)技術(shù)已被用于監(jiān)測各種小分子，如葡萄糖、乳酸、氨基酸、藥物等，然而通過伏安法檢測痕量金屬的例子卻寥寥無幾。細(xì)胞培養(yǎng)基中大量有機(jī)物質(zhì)的存在，給使用差分脈沖伏安法技術(shù)獲取可靠且強(qiáng)烈的信號帶來了挑戰(zhàn)。

為了將這種分析技術(shù)整合到體外系統(tǒng)中以實現(xiàn)離子的實時監(jiān)測，我們評估了不同細(xì)胞培養(yǎng)基中安培溶出伏安法（ASV）的性能，并設(shè)計并測試了一種培養(yǎng)基酸化方案，以增強(qiáng)伏安信號并降低檢測限。我們團(tuán)隊此前已通過機(jī)器學(xué)習(xí)方法證明了其提高檢測靈敏度的潛力。

首先，這種分析和預(yù)處理方法的潛力被應(yīng)用于通過從上室和下室抽取細(xì)胞培養(yǎng)基來監(jiān)測 Caco-2 細(xì)胞 Transwell? 培養(yǎng)模型中的銅濃度。然后，通過采用帶有微流控控制器/傳感器的商用芯片設(shè)計了一個微流控回路，以自動調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)基和酸化溶液的流量，從而實現(xiàn)自動酸化方案。此外，還在微流控回路中集成了一個微電極，以便在原位進(jìn)行陽極溶出伏安法測量。

所報告的結(jié)果代表了將化學(xué)傳感器集成到復(fù)雜器官芯片系統(tǒng)中的重要一步。事實上，據(jù)我們所知，目前還沒有將交流伏安法分析技術(shù)與自動化樣品處理相結(jié)合的器官芯片設(shè)備；這一方面對于評估此類復(fù)雜系統(tǒng)的性能至關(guān)重要。

圖 1. 集成于微流控芯片中的電化學(xué)傳感器，（a）微加工工藝示意圖；（b）準(zhǔn)備進(jìn)行校準(zhǔn)和實驗測試的最終裝置。

圖 1b 展示了最終集成有三個電極的傳感器圖像，已準(zhǔn)備好進(jìn)行校準(zhǔn)和實驗測試。

圖 2. 在 pH 值為 7.4 的條件下，采用三電極裝置的陽極溶出伏安法測定（a）MEM；（b）DMEM；（c）F12K；（d）MEM+ 中銅的含量。在 pH 值為 7.4 的 MEM、DMEM 和 F12K 中陽極溶出伏安法的校準(zhǔn)曲線（e）。累積電位：相對于 Ag/AgCl 為 -0.4 V；累積時間：30 秒；溶出掃描：-0.4 V 至 0.7 V（方波伏安法：脈沖幅度 30 mV，頻率 25 Hz，E 步長 4 mV）。

圖 3. 在 pH 值為 4 的條件下，采用三電極裝置的陽極溶出伏安法測定（a）MEM 中銅的含量；（b）DMEM 中銅的含量；（c）F12K 中銅的含量；（d）MEM+ 中銅的含量。在 pH 值為 4 的 MEM、DMEM、F12K 和 MEM+ 中陽極溶出伏安法的校準(zhǔn)曲線（e）。累積電位：相對于 Ag/AgCl 為 -0.4 V；累積時間：30 秒；溶出掃描：-0.4 V 至 0.7 V（方波伏安法：脈沖幅度 30 mV，頻率 25 Hz，E 步長 4 mV）。

圖 4. 采用三電極裝置的陽極溶出伏安法測定 Caco-2 細(xì)胞 Transwell? 培養(yǎng)模型中銅的含量：監(jiān)測時間分別為 0 小時和 72 小時，（a）10 μM Cu2+—生理 pH 值；（b）20 μM Cu2+—生理 pH 值；（c）10 μM Cu2+—酸性 pH 值；（d）20 μM Cu2+—酸性 pH 值。累積電位：相對于 Ag/AgCl 為 -0.4 V；累積時間：30 秒；溶出掃描：-0.4 V 至 0.7 V（方波伏安法：脈沖幅度 30 mV，頻率 25 Hz，E 步長 4 mV）。

圖 5. 采用表 1 中所列四種情況的商用平臺改造后的傳感室中可實現(xiàn)的混合時間和效率。

圖 6. 有限元分析得出的穩(wěn)態(tài)濃度分布，其中（a）ME = 99%，（b）ME = 81%。

圖 7. 集成離子傳感器的微流控芯片照片（a）；在芯片（檢測室）中使用三電極集成傳感器（微電極）進(jìn)行銅測定的陽極溶出伏安法（累積電位：相對于 Pt 的 -1.0 V；累積時間：100 秒；溶出掃描：-1.0 V 至 0.3 V（方波伏安法：脈沖幅度 30 mV，頻率 25 Hz 和 E 步長 4 mV）（b）；芯片（檢測室）中的校準(zhǔn)曲線（c）。

在細(xì)胞環(huán)境中檢測和監(jiān)測銅對于不同的生物學(xué)研究具有重要意義，有助于了解其在分子途徑中的作用、在體內(nèi)的調(diào)節(jié)機(jī)制以及與特定疾病的關(guān)系。特別是銅可通過飲食提供，并由腸上皮細(xì)胞吸收，從而維持全身的銅穩(wěn)態(tài)。盡管腸上皮細(xì)胞在銅的調(diào)節(jié)中起著重要作用，但其相關(guān)機(jī)制尚未完全闡明。通過將傳感器與細(xì)胞系統(tǒng)相結(jié)合，并模擬接近體內(nèi)條件的環(huán)境，可以研究此類機(jī)制。

基于上述背景，本研究對不同細(xì)胞培養(yǎng)基中銅離子的電化學(xué)傳感進(jìn)行了探究。在生理條件下（pH 7.4）進(jìn)行陽極溶出伏安法檢測時，在（亞）生理濃度的離子下觀察到中等強(qiáng)度的電流信號。設(shè)計并測試了一種細(xì)胞培養(yǎng)基酸化方案，以增強(qiáng)伏安峰并提高系統(tǒng)的響應(yīng)性，結(jié)果觀察到系統(tǒng)響應(yīng)性更高。事實上，酸化過程能夠促使培養(yǎng)基中存在的有機(jī)物質(zhì)與銅離子解離，從而增加可用電位溶出伏安法（ASV）技術(shù)測量的離子數(shù)量，進(jìn)而估算培養(yǎng)基中銅的總量。該酸化和檢測方案在體外系統(tǒng)中進(jìn)行了測試，通過使用 Caco-2 細(xì)胞 Transwell? 培養(yǎng)模型進(jìn)行測量。特別是，為了間接估算細(xì)胞吸收的銅離子量，可以隨時間監(jiān)測上室和下室培養(yǎng)基中的銅含量。腸道屏障僅能吸收生理濃度的銅，防止吸收過量的銅，因為過量的銅是有毒的。因此，通過量化培養(yǎng)基中的離子，可以提供細(xì)胞吸收量和腸道屏障完整性的信息。將這種檢測方案整合到器官芯片系統(tǒng)中，可以實現(xiàn)銅攝取和調(diào)節(jié)機(jī)制的自動監(jiān)測，還可以通過這種傳感系統(tǒng)與生化實驗的相關(guān)性方法進(jìn)行研究。因此，采用嵌入式集成微傳感器實現(xiàn)了用于酸化過程和銅檢測的微流控裝置，并對其進(jìn)行了研究。有限元分析模擬確定了在經(jīng)過改造的商用微流控平臺上實現(xiàn)介質(zhì)酸化所需的最佳注入條件，且在可接受的混合時間內(nèi)達(dá)到預(yù)期效果。

參考文獻(xiàn)：

Prontera, C.T.; Sciurti, E.; De Pascali, C.; Giampetruzzi, L.; Biscaglia, F.; Blasi, L.; Esposito, V.; Casino, F.; Siciliano, P.A.; Francioso, L.N. Anodic Stripping Voltammetric Determination of Copper Ions in Cell Culture Media: From Transwell? to Organ-on-Chip Systems. Chemosensors 2023, 11, 466.

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