導(dǎo)讀

盡管各國(guó)衛(wèi)生系統(tǒng)發(fā)展迅速，但由病原菌引起的傳染病仍然是人類(lèi)健康的主要威脅之一。據(jù)報(bào)道，全世界每年有220多萬(wàn)人死于水傳播大腸桿菌病原體。盡管大多數(shù)大腸菌群是無(wú)害的，但某些大腸桿菌的存在可能會(huì)導(dǎo)致甚至威脅到人類(lèi)健康，例如，大腸桿菌O157:H7和其他產(chǎn)志賀毒素的大腸桿菌菌株（非O157 STEC）是食源性疾病的常見(jiàn)因素，可能對(duì)健康造成嚴(yán)重后果，尤其是對(duì)幼兒。因此，檢測(cè)大腸桿菌對(duì)于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用以及食品、水和空氣質(zhì)量監(jiān)測(cè)非常重要。

大連理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，工業(yè)生態(tài)學(xué)與環(huán)境工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家，開(kāi)發(fā)出基于naica?全自動(dòng)微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的單細(xì)菌檢測(cè)方法，該方法可以在1.5小時(shí)內(nèi)以單細(xì)胞靈敏度選擇性檢測(cè)臨床尿液樣本中的大腸桿菌 。該方法發(fā)表在《Analytical Methods》，題為“Single bacteria detection by droplet DNAzyme-coupled rolling circle amplification”。

應(yīng)用亮點(diǎn)：

?  dDRCA系統(tǒng)，能夠快速、選擇性地檢測(cè)具有單細(xì)胞敏感性的大腸桿菌 ，dDRCA系統(tǒng)的檢測(cè)靈敏度比之前報(bào)道的PAD高1000倍。

? 證明了dDRCA系統(tǒng)在尿路感染診斷中的潛在臨床適用性，dDRCA能夠在不到1.5小時(shí)內(nèi)，從20份臨床尿液樣本中成功識(shí)別出5名UTI患者，而傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的方法需要數(shù)小時(shí)。

文中采用naica??全自動(dòng)微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)液滴微流控技術(shù)，快速精準(zhǔn)的檢測(cè)到復(fù)雜樣本和高背景樣本中的致病大腸桿菌。

通常擴(kuò)增需要約4小時(shí)進(jìn)行定量大腸桿菌檢測(cè)。在這項(xiàng)研究中，我們描述了DNA酶偶聯(lián)滾圈擴(kuò)增（RCA），這是一種高效的等溫酶DNA復(fù)制過(guò)程，可在naica??全自動(dòng)微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)上進(jìn)行，以建立液滴DNA酶偶聯(lián)RCA（表示為dDRCA）系統(tǒng)。我們進(jìn)一步證明，該系統(tǒng)能夠在1.5小時(shí)內(nèi)以單細(xì)胞敏感性選擇性檢測(cè)臨床尿液樣本中的大腸桿菌。

▲圖2（a）通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析RCA產(chǎn)物（RP）。（b） 反應(yīng)混合物在指示反應(yīng)條件下的熒光響應(yīng)：+RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli (blue line);  RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli (green line);  RFD-EC1/+ RDS/-E. coli (red line); + RFD-EC1/+ RDS/-E. coli (pink line)。（c） Naica Prism3閱讀器圖像（左）、CLSM圖像（中）和熒光顯微鏡圖像（右）為微晶芯片液滴的大小。比例尺：1.4 mm（左）和100 mm（中、右）。指示反應(yīng)條件下dDRCA系統(tǒng)的熒光圖像和熒光滴數(shù)：（d）+RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli;（e）-RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli; (f) -RFD-EC1/+ RDS/  E. coli; (g) + RFD-EC1/+ RDS/  E. coli.

使用Naica Prism3閱讀器對(duì)生成的熒光液滴進(jìn)行成像和分析。dDRCA系統(tǒng)能夠在75分鐘內(nèi)選擇性計(jì)數(shù)具有單細(xì)胞敏感性的大腸桿菌，包括20分鐘的細(xì)胞裂解時(shí)間、12分鐘的液滴生成時(shí)間和43分鐘的液滴反應(yīng)時(shí)間。

通過(guò)比較其他三種常見(jiàn)細(xì)菌，包括枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、酸性乳片球菌（P.acidilactici）和唐菖蒲伯克霍爾德菌（B.gladioli）存在時(shí)的信號(hào)反應(yīng)，也檢查了dDRCA檢測(cè)大腸桿菌的選擇性。當(dāng)用緩沖液或尿液中的這些意外靶點(diǎn)測(cè)試每個(gè)dDRCA系統(tǒng)時(shí)，未觀察到明顯的熒光液滴（圖4c和S4?）。

▲圖4（a）不同大腸桿菌濃度（每毫升細(xì)胞數(shù)）下dDRCA反應(yīng)的熒光圖像。比例尺：1.4 mm。（b） 不同濃度下計(jì)數(shù)的液滴數(shù)與大腸桿菌之間的關(guān)系。提供了計(jì)數(shù)的液滴數(shù)量，插圖顯示了1–104大腸桿菌范圍內(nèi)的線性反應(yīng)。誤差條代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。（c） dDRCA的特異性。

Z終證明了dDRCA系統(tǒng)在尿路感染（UTI）診斷中的潛在臨床適用性。分析了20份患者和健康獻(xiàn)血者的臨床尿樣。整個(gè)操作程序包括：（1）細(xì)胞收集和裂解（25分鐘）；（2） 液滴生成（12分鐘）；（3） 液滴反應(yīng)（43分鐘）。如圖5c所示，五個(gè)尿樣，即ID 6、8、9、12和14，比其他尿樣產(chǎn)生大量熒光液滴（>3000）。使用傳統(tǒng)的大腸桿菌培養(yǎng)方法進(jìn)一步確認(rèn)了這些有無(wú)大腸桿菌感染的樣本（圖5d）。因此，對(duì)UTI的診斷有很大的希望。

▲圖5（a）檢測(cè)尿液樣本中的大腸桿菌。（b） 顯示尿液樣本中計(jì)數(shù)數(shù)與大腸桿菌細(xì)胞在1-104范圍內(nèi)的線性相關(guān)性的曲線圖。（c） 20份臨床尿液樣本中陽(yáng)性液滴的數(shù)量。（d） CLED（胱氨酸、乳糖電解質(zhì)缺乏）瓊脂細(xì)菌尿液培養(yǎng)板。黃色菌落代表大腸桿菌在37℃的CLED瓊脂中培養(yǎng)22小時(shí)后的生長(zhǎng)。

該系統(tǒng)能夠在不到1.5小時(shí)的分析時(shí)間內(nèi)，從20份臨床尿液樣本中成功識(shí)別出5名UTI患者，而傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的方法需要數(shù)小時(shí)。

naica?六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國(guó)Stilla Technologies公司naica?六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動(dòng)化微滴生成和擴(kuò)增，每個(gè)樣本孔可實(shí)現(xiàn)6熒光通道的檢測(cè)，智能化識(shí)別微滴并進(jìn)行質(zhì)控，3小時(shí)內(nèi)即可獲得至少6個(gè)靶標(biāo)基因的絕對(duì)拷貝數(shù)濃度。