結(jié)核病是經(jīng)呼吸道傳播，由結(jié)核分枝桿菌（MTB）感染引起的傳染病。目前臨床結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是痰液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)[1]，但該方法檢測(cè)周期長(zhǎng)、陽性檢出率低，診斷性能欠佳。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） [2-4] 和酶聯(lián)免疫[5-6]法穩(wěn)定性差，假陽性率高。因此亟待開發(fā)一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、便捷、敏感度高的檢測(cè)手段，彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，實(shí)現(xiàn)結(jié)核病的早期預(yù)診。 

結(jié)核分枝桿菌分泌的 10 KDa 培養(yǎng)濾液蛋白（CFP-10）是一種低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，且為結(jié)核分枝桿菌在內(nèi)的少數(shù)致病性分枝桿菌所特有，因此可考慮 CFP-10 作為結(jié)核病早期診斷的生物標(biāo)志物[7]。目前血液中結(jié)核分枝桿菌分泌的 CFP-10 檢測(cè)采用 NanoDisk-MS 技術(shù)，該技術(shù)將抗體標(biāo)記的納米盤與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF-MS）相結(jié)合，具有較高的敏感性和特異性，但納米盤材料為實(shí)驗(yàn)室自制材料，限制了其在臨床上的應(yīng)用，且該方法僅能實(shí)現(xiàn)半定量[8]。因此，迫切需要開發(fā)新的血清中CFP-10 的質(zhì)譜檢測(cè)方法。三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)技術(shù)，通過對(duì)靶標(biāo)蛋白酶解產(chǎn)生的特異性肽段進(jìn)行質(zhì)譜監(jiān)測(cè)[9]，具有靈敏度高、分析速度快、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被視為靶向蛋白絕對(duì)定量的重要手段，并已應(yīng)用于特異性生物標(biāo)志物的篩選驗(yàn)證[10-12]。 

1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 

稱取 CFP-10 抗原適量，加 10%(V/V)乙腈（含 1%甲酸），配制成質(zhì)量濃度 1.0 mg/mL 的溶液作為貯備液，-20 ℃保存。再用空白血清稀釋貯備液，制成質(zhì)量濃度分別為 1.0，3.0，5.0，10，25，50，100 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。 

1.2 樣品前處理 

取 400 μL 人血清，加入 0.4 mL 乙腈，渦旋 1 min，于 12000 r/min 離心10 min 后，取上清液離心濃縮至干，依次加入 0.4 mL NH4HCO3 溶液（50 mmol/L）、胰蛋白酶溶液，混勻，于 60 ℃孵育 4 h 后取出，加入 1.6 mL 8%(V/V)H3PO4終止反應(yīng)，待固相萃取柱上樣。 

固相萃取：用 3 mL 甲醇活化，3 mL 水平衡強(qiáng)陰離子交換小柱后上樣，依次用 1 mL 5%(V/V)氨水、1 mL 5%(V/V)乙腈、1 mL 1%(V/V)甲酸水溶液清洗，用 1 mL 10%(V/V)乙腈（含 1%甲酸）洗脫，收集洗脫液，離心濃縮至干，復(fù)溶于 100 μL 10%(V/V)乙腈（含 1%甲酸），于 10000 r/min 離心10 min 后取上清液，待 UPLC-MS/MS分析。 

1.3 測(cè)定條件 

色譜柱：Phenomenx Luna Omega PS-C18 柱（2.1 mm×50 mm，1.6 μm）；柱溫：60 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相 A：0.1%甲酸水溶液（含 100 μmol/L NH4F），流動(dòng)相B：乙腈；梯度洗脫：0 ~ 1 min， 5% B; 1 ~ 3 min，5%~20% B; 3 ~ 6.5 min，20%~25% B; 6.5 ~ 7.5 min，25%~95% B; 7.5 ~ 8 min，95%~5% B; 8 ~ 10 min，5% B。 

電噴霧離子源，正離子模式（ESI+）；離子源溫度：150 ℃，毛細(xì)管電壓：3.0 kV；脫溶劑氣溫度：500 ℃；流速：1000 L/h；錐孔氣流速：150 L/h；霧化器壓力：7.0 bar。監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。CFP-10特異性肽段 TDAATLAQEAGNFER 的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)：母離子 m/z 797.5；子離子：m/z 1021.5，822.5，定量離子為 m/z 1021.5；錐孔電壓：60，60 V；碰撞能量：30，25 eV。 

2.1 色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化 

在 ESI+模式下，對(duì) CFP-10 特異性肽段的離子源參數(shù)和碰撞能量等進(jìn)行優(yōu)化，確定質(zhì)譜信號(hào)較高的參數(shù)。首先對(duì) CFP-10 特異性肽段（m/z 1593.75）進(jìn)行全掃描分析，檢測(cè)到[M+2H]2+（m/z 797.5）質(zhì)譜峰作為母離子，優(yōu)化碰撞能量、錐孔電壓等參數(shù)，確定了定量和定性離子。CFP-10 特異性肽段的二級(jí)質(zhì)譜圖見圖 1。 

圖1 CFP-10特異性肽段的子離子掃描質(zhì)譜圖

實(shí)驗(yàn)選擇 Phenomenx Luna Omega PS-C18（2.1 mm×50 mm，1.6 μm）色譜柱，以甲酸水溶液-乙腈流動(dòng)相體系進(jìn)行梯度分離，比較了不同體積分?jǐn)?shù)甲酸水溶液（0%，0.1%，0.2%，0.3%）-乙腈流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)在水溶液中添加 0.1%甲酸時(shí)，CFP-10 特異性肽段的質(zhì)譜響應(yīng)最高。為進(jìn)一步降低背景干擾，提高電離效率，在 0.1%甲酸水溶液中添加 50，100，200，500 μmol/L NH4F，發(fā)現(xiàn) CFP-10 特異性肽段的質(zhì)譜響應(yīng)均有所提高，且在添加 100 μmol/L NH4F 時(shí)質(zhì)譜響應(yīng)最強(qiáng)，這可能是由于在 ESI+模式下，游離氟離子與Na+形成 NaF，減少了[M+Na]+的生成，從而提高了電離效率。實(shí)驗(yàn)最終確定流動(dòng)相體系為乙腈-0.1%甲酸水溶液（含 100 μmol/L NH4F）。對(duì)柱溫、流速等條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見 1.4 節(jié)色譜條件。 

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化 

本實(shí)驗(yàn)首先采用蛋白沉淀法對(duì)血清樣品進(jìn)行預(yù)處理，并對(duì)不同沉淀劑（甲醇、乙腈）的沉淀效果進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈沉淀效果更好。繼而對(duì)血清與乙腈的體積比（0.8:1，1:1，1.2:1，1.4:1）進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)血清與乙腈體積比為 1:1 時(shí)，酶解效率最高。本實(shí)驗(yàn)通過蛋白質(zhì)沉淀除去部分高豐度蛋白后，對(duì)血清樣品進(jìn)行酶解，并對(duì)酶活性進(jìn)行優(yōu)化。選擇不同活性的 3 種胰蛋白酶（a，b，c）考察酶解效率，結(jié)果表明活性最高的胰蛋白酶 c 酶解效率最高，但其價(jià)格較胰蛋白酶 b 高出1500 倍，而其酶解效率僅為胰蛋白酶 b的 1.5 倍?？紤]到經(jīng)濟(jì)效益，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選中等酶活性的胰蛋白酶 b。實(shí)驗(yàn)還對(duì)酶用量、酶解時(shí)間和溫度進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見 1.3 節(jié)，當(dāng) CFP-10 抗原與胰蛋白酶 b 的質(zhì)量比為 5 時(shí)，于 60 ℃下酶解 4 h，可獲得最高的酶解效率。采用 10%(V/V)乙腈（含1%甲酸）作為洗脫劑時(shí)洗脫效率最高，收集的洗脫液采用 20%(V/V)乙腈（含 1%甲酸）作為復(fù)溶溶劑時(shí)峰面積最高，但峰形差，溶劑效應(yīng)強(qiáng)。綜合考慮，選擇 10%(V/V)乙腈（含 1%甲酸）作為復(fù)溶溶劑。 

圖2 (a) 空白血清、(b) 實(shí)際結(jié)核病人血清樣本和(c)空白血清+CFP-10 的色譜圖 

2.3.2 線性范圍、檢出限和定量限  將 CFP-10 標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白血清樣品中，配制不同濃度（1.0，3.0， 5.0，10，25，50，100 ng/mL）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按 1.3 節(jié)方法處理后上機(jī)測(cè)定。以 CFP-10 濃度（x，ng/mL）為橫坐標(biāo)，以 CFP-10 特異性肽段峰面積（y ）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程y=39.5355x–15.8826，相關(guān)系數(shù) r2=0.9906，表明 CFP-10 在 3~100 ng/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。以 3倍信噪比（S/N）對(duì)應(yīng)的 CFP-10 的質(zhì)量濃度作為方法的檢出限（LOD），10 倍 S/N 對(duì)應(yīng)的 CFP-10 的質(zhì)量濃度作為方法的定量限（LOQ），因此本方法的 LOD 和 LOQ 分別為 1.0 和 3.0 ng/mL。 

2.3.3 加標(biāo)回收率及精密度  取空白血清，分別配制低、中、高（10，25，100 ng/mL）3 個(gè)濃度水平的質(zhì)控樣品，各濃度平行制備 3 份，按 1.3 節(jié)方法處理后上機(jī)測(cè)定。連續(xù) 3 日重復(fù)加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，對(duì)日間精密度進(jìn)行考察。如表 1 所示，CFP-10 在低、中、高 3 個(gè)添加水平下的回收率為 89.8%~108.1%，且日內(nèi)和日間結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均低于 10%，表明方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，滿足生物樣本分析要求。 

表1 血清中CFP-10的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (n=3)

2. 3. 4 穩(wěn)定性  取低、中、高 3 個(gè)濃度水平的質(zhì)控樣品，按 1.3 節(jié)方法處理后置于自動(dòng)進(jìn)樣盤（10 ℃）中，分別于 0，2，4，8，12，24 h 進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，測(cè)得 CFP-10 含量結(jié)果的 RSD 為 2.5%~5.7%，日內(nèi)穩(wěn)定性良好。取低、中、高 3 個(gè)濃度水平的質(zhì)控樣品，按 1.3 節(jié)方法處理后于-20 ℃冷凍保存，分別于 1，3， 5，7 d 解凍后測(cè)定，測(cè)得 CFP-10 含量結(jié)果的 RSD 為 5.0%~9.8%，表明樣品在-20 ℃貯存 7 d 穩(wěn)定。 

2.3.5 與其他方法比較 將本方法與文獻(xiàn)報(bào)道的抗酸染色涂片法（AAS）、分枝桿菌培養(yǎng)法、基于PCR 的Xpert MTB/RIF、基于 ELISA 的結(jié)核 γ-干擾素釋放法（IGRA）進(jìn)行比較，結(jié)果見表 2。本方法敏感性高于 AAS法和分枝桿菌培養(yǎng)法，操作時(shí)間短，8 h 內(nèi)便可獲取結(jié)果；采用血清樣本，易于獲取，對(duì)于結(jié)核癥狀改善后痰液難獲取的情況[8]，可作為經(jīng)典方法的有力補(bǔ)充。  

表2 本方法與其他報(bào)道的檢測(cè)方法比較 

AAS: antiacid stains smear; IGRA: interferon γ release assay；Sensitivity = number of true positives / (number of true positives + number of false negatives) × 100%；Specificity = number of true negatives / (number of true negatives + number of false positives) × 100%.

圖3 結(jié)核病和非結(jié)核病例中CFP-10 的濃度