介紹

基于重力柱的液相色譜純化方法是一種常見(jiàn)但速度緩慢且資源集中的化合物純化技術(shù)。將重力法過(guò)渡到自動(dòng) Flash 色譜法大大提高了進(jìn)樣量，減少了運(yùn)行時(shí)間，并減少了純化過(guò)程中使用的溶劑。在本文中，將重力柱色譜技術(shù)與基于分離兩種染料的 Pure C-815 Flash 系統(tǒng)的 Flash 法進(jìn)行了比較。Pure Navigator? 軟件可用于計(jì)算優(yōu)化使用不含氯的溶劑梯度解決方案。優(yōu)化的溶劑系統(tǒng)允許每次運(yùn)行能純化更多的樣品。

設(shè)備、試劑和材料

設(shè)備：

• 重力柱色譜，玻璃柱中填充了硅膠和 FC60 支架

• C-815 快速色譜系統(tǒng)，由三活塞泵、200nm-800nm 紫外線檢測(cè)器、DAD、ELSD、封閉式餾分收集器，18x150mm 支架組成

• Flash 色譜柱，F(xiàn)lashPure EcoFlex Silica 12g（50μm）和FlashPure Select Silica 12g（15μm）

試劑和材料：

• 蘇丹黃

• 蘇丹紅 G

• 硅膠（50μm）

• 己烷

• 乙酸乙酯

• 二氯甲烷（DCM）

實(shí)驗(yàn)流程

樣品：

分別取 25mg 蘇丹黃和蘇丹紅，溶解在 50mL 二氯甲烷中。對(duì)于 實(shí)驗(yàn)3 和 實(shí)驗(yàn)4，將 25mg 蘇丹黃和 25mg 蘇丹紅溶于 50mL 己烷/乙酸乙酯 7:3 V/V 中。

分離：

用相同質(zhì)量的硅膠（12g 作為固定相）填充玻璃柱和預(yù)填充的色譜柱。將 12g 硅膠和約 60mL 二氯甲烷的漿料混合物填充到玻璃柱中。將硅膠色譜柱以 20mL 二氯甲烷/分鐘的流速處理 2 分鐘。將染料溶液加載到兩個(gè)柱中，并開(kāi)始洗脫程序（詳細(xì)信息見(jiàn) 表1）。使用 Pure Navigator? 軟件計(jì)算的己烷/乙酸乙酯進(jìn)行梯度分離， 3:10 至 1:2 梯度分離分離 2 分鐘，保持 1:2 等度 2 分鐘。進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)來(lái)確定可以最大分離的，并觀察兩種染料是否充分分離。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

比較 FlashPure EcoFlex 硅膠柱與敞口玻璃柱

在所有條件下，染料溶液似乎都被分離成紅色和黃色成分(圖1)。

預(yù)填充色譜柱比自填充柱表現(xiàn)更好，所收集的餾分的顏色分離更干凈(圖2)。對(duì)于使用等壓二氯甲烷流動(dòng)相系統(tǒng)的分離，性能上的差異可以與 Flash 相對(duì)于重力柱的效率和流速的提高有關(guān)。

將流動(dòng)相改為己烷和乙酸乙酯，采用線性梯度進(jìn)一步優(yōu)化了分離效果。在這些實(shí)驗(yàn)中，可以根據(jù)染料的 Rf 值定制色譜條件，最大限度地提高進(jìn)樣能力和純度。

Flash 色譜法優(yōu)化

進(jìn)一步修改了上樣量、預(yù)填充柱類(lèi)型、溶劑系統(tǒng)和溶劑體積，以調(diào)整閃蒸色譜法的性能，并建立溶劑使用和成本的估計(jì)。實(shí)驗(yàn)參數(shù)、實(shí)驗(yàn)時(shí)間、實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn) 表1。

在 Pure C-815 Flash上，樣本在 EcoFlex 硅膠色譜柱中分離純化，帶有等度洗脫(二氯甲烷，實(shí)驗(yàn)2)和梯度洗脫（己烷/乙酸乙酯，實(shí)驗(yàn)3）。切換到梯度模式有助于增加樣品的進(jìn)樣量(從 0.5mL 到 1mL)和分離效率（見(jiàn) 圖3 和 圖4）。

最好的結(jié)果可以通過(guò)使用高性能 FlashPure Select 硅膠色譜柱 (實(shí)驗(yàn)4)來(lái)實(shí)現(xiàn)，即使在高 4 倍的進(jìn)樣量的情況下（見(jiàn) 圖5），也能提供更好的分辨率，比 實(shí)驗(yàn)1提高 62.5%。

溶劑節(jié)約和 ROI

運(yùn)行成本（對(duì)美國(guó)而言）是根據(jù) 實(shí)驗(yàn)1 和 實(shí)驗(yàn)4 的實(shí)驗(yàn)參數(shù)估算的，使用的是 Fisher Scientific 公布的溶劑目錄價(jià)格，以及 FlashPure 在發(fā)布時(shí)的一次性色譜柱的目錄價(jià)格。假定作業(yè)人員的工資為每小時(shí) $22.50，并列入業(yè)務(wù)費(fèi)用概算。重力法的啟動(dòng)成本，包括玻璃柱、帶底座的垂直支架、餾分收集架和硅膠填料的價(jià)格。Flash 色譜法的啟動(dòng)成本，包括 Pure C-815 和色譜架的成本。所有數(shù)據(jù)歸一化，以顯示每 1.0mL 進(jìn)樣量的染料混合物所需的成本和時(shí)間。

表2a：使用敞口玻璃柱的重力色譜的啟動(dòng)和運(yùn)行成本，成本是基于在美國(guó)的定價(jià)。

表2b：使用 Flash 色譜法的啟動(dòng)和操作成本，成本是基于在美國(guó)的定價(jià)。

基于以上信息，重力色譜法和 Flash 色譜法的累積成本相等的點(diǎn)大約是 754 次。如果實(shí)驗(yàn)室通常每天進(jìn)行兩次重力純化，并使用 Flash 色譜法切換到每天兩次運(yùn)行，則投資回報(bào)率將在 377 個(gè)工作日內(nèi)達(dá)到。然而，如果實(shí)驗(yàn)室每天進(jìn)行更多的 5-10 次 Flash 純化，則盈虧平衡點(diǎn)將在 75 至 150 個(gè)工作日之間發(fā)生。

結(jié)論

使用等效的溶劑系統(tǒng)，將開(kāi)柱法染料純化過(guò)渡到自動(dòng)化的 Pure C-815 快速色譜系統(tǒng)，可以節(jié)省大量的時(shí)間和成本，同時(shí)還降低了與柱制備相關(guān)的操作風(fēng)險(xiǎn)，并提高了所得餾分的純度。通過(guò)使用 Pure Navigator? 產(chǎn)生適當(dāng)?shù)亩軇┨荻龋M(jìn)一步優(yōu)化了純化，同時(shí)消除了氯化溶劑系統(tǒng)的需要。這種方法提供了更高的進(jìn)樣能力，更高的產(chǎn)品純度和最佳的效率，同時(shí)減少了操作員接觸潛在危險(xiǎn)的硅膠及氯化溶劑。

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