單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是基因組中的一種 DNA 多態(tài)性，其由 DNA 序列中的單個(gè)核苷酸變化引起¹，它是人類可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一種。由于單核苷酸突變引起的氨基酸取代可能在一定程度上改變蛋白質(zhì)功能，因此單核苷酸改變?yōu)榈鞍踪|(zhì)功能創(chuàng)造了新的可能²。特定的單核苷酸改變可以改變與農(nóng)藝性狀密切相關(guān)的蛋白質(zhì)功能，進(jìn)而被用作作物遺傳改良的重要工具³。由于單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的不同會(huì)影響遺傳表型變異，且與性狀基因或等位基因完全關(guān)聯(lián)，所以其功能標(biāo)記作用優(yōu)于隨機(jī) DNA 標(biāo)記如 RFLPs、SSRs 和 AFLPs，并且被認(rèn)為是更準(zhǔn)確有效的進(jìn)行基因鑒定和標(biāo)記輔助⁴。 

SNP 基因分型最早的檢測(cè)方法之一是 TaqMan 系統(tǒng)，基于熒光標(biāo)記的等位基因特異性探針，使用基于實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的分析進(jìn)行檢測(cè)。另一項(xiàng) SNP 基因分型技術(shù)是競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性 PCR （KASP），使用終點(diǎn)熒光檢測(cè)來(lái)區(qū)分標(biāo)記的等位基因，用于鑒定和測(cè)量發(fā)生在核苷酸水平的遺傳變異，以檢測(cè) SNP。KASP 技術(shù)具有低成本、高通量的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于人類、動(dòng)物和植物遺傳學(xué)領(lǐng)域⁵。

第一步 PCR 循環(huán)-模板變性和組分退火：其中一種等位基因特異性引物和通用反向引物與目標(biāo) SNP 匹配并結(jié)合，擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域。

第二步 PCR 循環(huán)-等位基因特異性末端序列互補(bǔ)鏈的生成。

第三步 PCR 循環(huán)-產(chǎn)生信號(hào)：在接下來(lái)的 PCR 循環(huán)中，等位基因特異性末端序列不斷增加，F(xiàn)RET 盒中熒光所標(biāo)記的序列部分因?yàn)閺拇銣缧蛄兄嗅尫懦鰜?lái)而最終產(chǎn)生了熒光信號(hào)，可通過(guò)熒光微孔板讀板機(jī)獲取熒光信號(hào)。

KASP 分析由于其高通量、低成本、靈敏度高和對(duì)輸入 DNA 的質(zhì)量和數(shù)量變化的耐受性而被廣泛用于基因分型。并且適用于各種實(shí)時(shí) PCR 儀器或者熒光微孔板讀板機(jī)。

KASP 技術(shù)在種質(zhì)資源鑒定、親緣關(guān)系研究、分子標(biāo)記輔助育種、遺傳圖譜構(gòu)建與基因定位、種子純度鑒定等應(yīng)用廣泛。例如，西瓜抗性基因的鑒定，使用 KASP 標(biāo)記進(jìn)行 QTL 連鎖分析結(jié)果進(jìn)一步繪制了 SNP 標(biāo)記 KASP_JS9383 和 KASP_JS9168 之間的GSB 抗性位點(diǎn)，進(jìn)一步為西瓜育種計(jì)劃中該基因座的標(biāo)記輔助選擇提供有用的工具⁶。

另外，在人類疾病方面，KASP 也發(fā)揮了巨大的優(yōu)勢(shì)，許多遺傳病由點(diǎn)突變或者堿基片段插入缺失導(dǎo)致，KASP 基因分型技術(shù)可用于該類型的遺傳病檢測(cè)，如先天性耳聾、白化病、地中海貧血、苯丙酮尿癥、家族性遺傳性腎炎、色盲、血友病等。通過(guò) KASP 基因分型檢測(cè)，可以了解是否有易感風(fēng)險(xiǎn)，如心腦血管疾病、自身免疫性疾病、腫瘤或帕金森等，判斷個(gè)體攜帶的基因型，從而預(yù)知風(fēng)險(xiǎn)，可進(jìn)行早期干預(yù)。例如，通過(guò)對(duì) 649 例帕金森病患者基因分型，并選擇 355 名健康人作為對(duì)照組。采用競(jìng)爭(zhēng)等位基因特異性 PCR （KASP）技術(shù)檢測(cè)兩組人群中 rs11868035 和 rs2823357 基因型和等位基因的頻率分布。來(lái)探索兩個(gè)功能基因之間的潛在關(guān)聯(lián) SREBF1 基因 rs11868035 和 USP25 基因 rs2823357 與中國(guó)東北地區(qū)人群帕金森病病易感性的關(guān)系，通過(guò)使用 SpextraMax M5 進(jìn)行檢測(cè)，最終結(jié)果顯示多態(tài)性 SREBF1rs11868035 基因可能增加中國(guó)東北人群對(duì)帕金森病的易感性，而 USP25rs2823357 基因可能與中國(guó)東北人帕金森病的易感性無(wú)關(guān)。G/A 變異的 PD 患者可能會(huì)加重他們的運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能障礙⁷。

KASP 技術(shù)的應(yīng)用在全球發(fā)表約 3000 余篇科技論文。植物方面涉及水稻、小麥、玉米等主糧作物的功能基因定位和分子標(biāo)記輔助育種，還有花生、大豆、茶葉、中草藥等。畜牧方面主要為牛、羊、驢等。人類醫(yī)學(xué)研究包括糖尿病、結(jié)直腸癌、冠狀動(dòng)脈狹窄、動(dòng)脈瘤、胃癌、聽(tīng)力喪失、阿茲海默、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、關(guān)節(jié)炎等。

驗(yàn)證試劑盒包含 36 個(gè)已知樣品，包括 33 個(gè) DNA 樣品和 3 個(gè)無(wú)模板對(duì)照 （NTC）。每個(gè)樣品以 5 μL 量加入 96 孔板中進(jìn)行 PCR。相同體積的基因分型混合物（2x KASP Master 混合物加 KASP 測(cè)定混合物）添加到每孔中。參考染料 ROX 也包含在 KASP Master 混合物中。用干凈薄膜密封孔板并以 560 x g 離心一分鐘。立即啟動(dòng)熱循環(huán)反應(yīng)。熱循環(huán)反應(yīng)完成后，每個(gè)樣品取 5 μL 轉(zhuǎn)移到 384 孔板中，并在微孔讀板機(jī)中使用表 1 中的 MD 多功能酶標(biāo)儀參數(shù)設(shè)置進(jìn)行檢測(cè)，本次實(shí)驗(yàn)使用 SpectraMax M5e 和 SpectraMax i3x 進(jìn)行檢測(cè)。

表 1 讀板機(jī)設(shè)置用于數(shù)據(jù)采集

ROX 標(biāo)準(zhǔn)化的擴(kuò)增 DNA 樣品熒光在 SoftMax Pro 軟件中繪制曲線（圖 1）。三個(gè)顯著的集群被檢測(cè)出來(lái)。FAM 純合子位置靠近X軸，而 HEX 純合子則位置靠近 Y 軸，包含 FAM 和 HEX 的雜合樣品所形成的的集群在兩個(gè)純合子集群之間。無(wú)模板對(duì)照形成的集群如預(yù)期靠近最初位置。所得數(shù)據(jù)與供應(yīng)商的驗(yàn)證試劑盒基因分型結(jié)果高度一致。

圖 1 KASP 基因分型結(jié)果。PCR 產(chǎn)物在讀板機(jī)上得到三個(gè)不同集群，包括 FAM 純合子 ( 藍(lán)色 )，HEX 純合子 ( 紅色 ) 和 FAM/HEX 雜合子 ( 綠色 )。無(wú)模板對(duì)照(NTC) 集群接近最初位置

SpectraMax i3x 高通量多功能光學(xué)檢測(cè)平臺(tái) 

SpectraMax M5e多功能微孔板讀板機(jī)