據(jù)統(tǒng)計，自然界中90%以上微生物尚未獲得純培養(yǎng)菌株，這嚴重制約了我們對微生物資源的開發(fā)利用。微生物界的這些“暗物質(zhì)”由于生長速度不占優(yōu)勢、培養(yǎng)條件未知等因素，難以在平皿中生長，無法獲得菌株；而目前廣泛應用的宏基因組技術雖然能在一定程度上檢測未培養(yǎng)微生物的功能基因，但無法驗證其準確性。

另一方面，即便通過培養(yǎng)組學等技術，能夠使更多微生物可以在平皿中形成菌落，但對其篩選仍然面臨挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)人工平板培養(yǎng)法，工作量大，隨機性強，篩菌周期長，新菌獲取效率低；而應用機械臂的無差別高通量挑菌法，由于優(yōu)勢菌株反復被挑取，后續(xù)鑒定成本非常高。

可見，不論是針對可培養(yǎng)還是未培養(yǎng)微生物，新型篩選策略與工具都至關重要。

人工平板篩菌對目標菌的選擇依賴于操作者的經(jīng)驗，從中挑取具有不同形態(tài)的菌落，但難免錯漏，特別是待篩選的平皿數(shù)量大的時候。并且肉眼很難分辨菌落微觀形態(tài)的細微差異，導致菌株丟失。2023年，Harris H. Wang教授團隊^[1]應用機器學習算法基于菌落微觀圖像的差異進行分類和篩選，結(jié)果表明其獲得新菌的效率要遠遠高于人工篩選。

圖2 使用自動化和機器學習的高通量微生物培養(yǎng)組學^[1]

可見，若能夠在培養(yǎng)皿原位基于菌落表型信息，實現(xiàn)準確、客觀、自動化的菌株“去重復”，可以極大提高篩菌效率。除文獻中報到的菌落形態(tài)外，菌落的拉曼光譜信息也可作為去重篩選的依據(jù)。

針對尚無法在平皿上形成菌落的未培養(yǎng)微生物，目前廣泛采用宏基因組測序技術進行研究。宏基因組學雖然能夠揭示微生物群落的多樣性和復雜性，但無法定義或驗證復雜微生物群落中個體成員的作用。單細胞技術能夠繞過培養(yǎng)階段，實現(xiàn)對微生物細胞在原位群落中特性的逐一表征，為研究未培養(yǎng)微生物提供了一種新策略。

圖3 微生物單細胞研究意義^[2]

在單細胞表型檢測方面，可以通過形態(tài)、熒光、光譜等檢測技術，從群體中快速識別并鎖定目標單細胞；隨后，應用基于激光誘導向前轉(zhuǎn)移（LIFT）等單細胞分離技術，將目標菌精準分離出來，進行培養(yǎng)或基因分析。這有助于跨越“未培養(yǎng)微生物”這一技術難題，推進環(huán)境微生物資源開發(fā)進程。

自主開發(fā)了多模態(tài)、跨尺度微生物篩選平臺，在單細胞、單克隆兩個維度上實現(xiàn)基于形態(tài)、熒光、拉曼光譜的多模態(tài)微生物個體表征，及自動化單細胞/單克隆篩選，解決微生物篩選過程中隨機性強、重復率高、鑒定成本高、篩選周期長、低豐度及未培養(yǎng)菌無法獲得等問題。為微生物資源庫構(gòu)建、功能菌株篩選提供前沿工具平臺。

• 可培養(yǎng)微生物——菌落原位

• 未培養(yǎng)微生物——單細胞尺度

  
  

圖4 多模態(tài)、跨尺度微生物篩選平臺

針對可培養(yǎng)微生物，推出RAcolony高通量菌落智能篩選系統(tǒng)（RAcolony 高通量菌落智能篩選系統(tǒng) (qq.com)），創(chuàng)新性地將菌落宏觀成像、微觀圖像AI特征提取、拉曼“分子指紋”智能分析與自動化挑取工作站相結(jié)合，在培養(yǎng)皿原位實現(xiàn)菌落的去重復，解決傳統(tǒng)方法優(yōu)勢菌株反復被挑取的難題。

針對未培養(yǎng)微生物，PRECI SCS-R300拉曼單細胞分選儀（PRECI SCS-R300 拉曼單細胞分選儀 (qq.com)）、SC-catcher單細胞顯微光鑷操縱與分選系統(tǒng)（SC-catcher單細胞光鑷操縱與分選系統(tǒng) (qq.com)）、S3000超快三維熒光成像系統(tǒng)（S3000 超快三維熒光成像系統(tǒng) (qq.com)）等設備，能夠在微生物單細胞層面上對目標菌進行表征和篩分，解決宏基因組學無法準確建立表型與基因型間聯(lián)系的瓶頸問題，實現(xiàn)功能微生物單細胞的靶向篩選。

應用多模態(tài)、跨尺度微生物篩選平臺，建立了從樣品前處理到單細胞表型檢測-可視化分選/菌落原位去重篩選，以及單細胞測序、培養(yǎng)等全流程解決方案。

在樣品前處理階段，可應用磁性納米顆粒等技術實現(xiàn)低豐度菌株的有效富集（功能菌株篩選全流程解決方案丨低豐度功能菌富集篇 (qq.com)）。隨后將樣品分為2份，1份用于鋪板培養(yǎng)，使用RAcolony高通量菌落智能篩選系統(tǒng)，高效獲得更高覆蓋率的菌株；另1份樣品根據(jù)實際情況，可進行熒光原位雜交（FISH）（5個步驟掌握FISH技術：高效探索微生物世界 (qq.com)）、穩(wěn)定同位素（SIP）（微生物研究的新視角丨SIP-穩(wěn)定同位素技術與拉曼光譜的聯(lián)合應用 (qq.com)）等標記，再分別使用S3000超快三維熒光成像系統(tǒng)、P300共聚焦拉曼光譜儀或PRECI SCS-R300微生物單細胞多模態(tài)分析與分選系統(tǒng)進行形態(tài)、熒光或拉曼光譜的檢測。識別到的目標菌，應用LIFT單細胞分選（PRECI SCS｜微生物單細胞解決方案 (qq.com)）或光鑷技術將其精準地分離到裂解液、培養(yǎng)基或基質(zhì)液中，從而實現(xiàn)單細胞的多組學研究。

微生物資源開發(fā)的道路充滿艱辛，推出的多模態(tài)、跨尺度微生物篩選平臺，幫助研究者踏平坎坷成大道，助力環(huán)境微生物資源開發(fā)事業(yè)的長足發(fā)展。

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參考文獻：

[1]Yiming Huang, Ravi U. Sheth, Shijie Zhao et al., High-throughput microbial culturomics using automation and machine learning, Nature Biotechnology, 2023, 41, 1424-1433

[2]Roland Hatzenpichler, Viola Krukenberg, Rachel L. Spietz & Zackary J. Jay, Next-generation physiology approaches to study microbiome function at single cell level, 2020, Nature Reviews Microbiology, 18, 241-256

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