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單細(xì)胞測序技術(shù)，不是只有BD和10×Genomics

來源：翌圣生物科技(上海)股份有限公司 更新時間：2024-12-25 14:39:06 閱讀量：165
單細(xì)胞測序技術(shù)指的是通過高通量測序技術(shù)（NGS，Next Generation Sequencing）分析每一個單個細(xì)胞的序列信息，從而更高分辨率地揭示細(xì)胞間的細(xì)胞差異以及其在微環(huán)境中的功能情況。
 
為什么要做單細(xì)胞測序
單細(xì)胞測序發(fā)展的十余年，使得我們所認(rèn)知的這個世界越來越精準(zhǔn)。我們傳統(tǒng)的測序方法，是在組織水平或者說多細(xì)胞水平上進行的，最終得到的數(shù)據(jù)其實是從多個或者多類細(xì)胞中得到的平均值，但是無法明確細(xì)胞異質(zhì)性的信息。而單細(xì)胞測序，則能夠在更精細(xì)的單個細(xì)胞水平上獲得遺傳信息，從而揭示每個細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)狀態(tài)，反映常規(guī)測序所無法得到的異質(zhì)性信息和稀有細(xì)胞的遺傳信息。因此也有人稱單細(xì)胞測序為NGS的“顯微鏡”。
徐1.jpg圖1. 單細(xì)胞測序發(fā)展歷程
 
單細(xì)胞測序技術(shù)的難點
單細(xì)胞測序最大的局限性在于待測核酸的含量，如一個細(xì)胞里的DNA或RNA含量僅僅處在皮克 (picograms) 級水平，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到現(xiàn)有建庫試劑盒的最低投入量需求。因此，必須先對單細(xì)胞內(nèi)的微量核酸分子進行擴增，而且必須保證盡可能少地出現(xiàn)技術(shù)誤差，以便開展后續(xù)的測序及其它研究。其次高通量單細(xì)胞測序需要增加捕獲效率，提高靈敏度。除此之外，樣本處理過程中對于稀有樣本的獲取和難解離組織的細(xì)胞分離，也是很大的挑戰(zhàn)。
 
主要的幾種單細(xì)胞測序技術(shù)

◎ 基于微流控液滴的10× Genomics

10×genomics 公司的 Chromium 系統(tǒng)，利用微流控技術(shù)將細(xì)胞自動分配到 100,000到 1,000,000微反應(yīng)體系，每個微反應(yīng)體系含有一種特定的 barcode 序列；含有 barcode 信息的凝膠珠子（GEMs）首先與樣品和酶的混合物混合，然后與位于微流體「雙十字」連接中的油表面活性劑溶液結(jié)合；GEMs 流到儲液器中并進行收集。凝膠珠子溶解釋放 barcode 序列，開始對樣本進行標(biāo)記；最后將每個液滴中含有 barcode 信息的產(chǎn)物混合，然后構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)測序文庫。
10×genomics的優(yōu)勢在于細(xì)胞通量高，建庫周期短，操作簡便，具有超高的捕獲效率。不足之處在于只能獲得3’端的轉(zhuǎn)錄本信息，且樣本要求高。
徐2.jpg圖2. 10×genomics測序原理

 

◎ 基于微孔板的BD Rhapsody

BD Rhapsody 技術(shù)利用卡式芯片在磁性的寡核苷酸條形碼標(biāo)記微球上實現(xiàn)單細(xì)胞捕獲和 mRNA 轉(zhuǎn)錄本的分子標(biāo)簽，然后將這些微球合并到單個管中用于 cDNA 擴增和文庫構(gòu)建?？蓾M足 100~10,000 個細(xì)胞的自動分選、擴增及建庫。此外，該技術(shù)使用帶有寡核苷酸的高質(zhì)量抗體（Ab-oligos），這條寡核苷酸帶有抗體特異的條形碼，細(xì)胞在經(jīng)過 Ab-oligos 標(biāo)記后，可在單細(xì)胞水平同時獲得轉(zhuǎn)錄組和蛋白表達(dá)。
相比于10×genomics，BD Rhapsody在捕獲效率和有效性上有一定優(yōu)勢。
徐3.jpg圖3. BD Rhapsody測序原理

 

◎ 基于PCR擴增的Smart-seq技術(shù)

Smart-Seq（Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript）是一項具里程碑意義的技術(shù)。細(xì)胞被裂解后，將RNA與包含oligo(dT)的引物雜交。然后添加幾個無模板的C核苷酸，生成第一條鏈。這種poly(C)垂懸只添加到全長轉(zhuǎn)錄本上。然后將寡核苷酸引物與poly(C)突出雜交，合成第二條鏈。全長cDNA經(jīng)過PCR擴增，以獲得納克級的DNA。PCR產(chǎn)物純化后可用于測序。在后來又有學(xué)者對該技術(shù)進行改進，新方案使用鎖核酸（LNA）、更高濃度的MgCl2以及甜菜堿。它不再需要純化步驟，可大大提高產(chǎn)量。
Smart-seq相比較于10×genomics檢測到的轉(zhuǎn)錄本更多，但是不足在于測序reads無法實現(xiàn)鏈特異性，同時由于對聚腺苷酸化的RNA具有選擇性，因此不適用于分析非poly(A)的RNA。
徐4.jpg

圖4. Smart-seq測序原理
 

◎ 基于線性擴增的MARS-seq技術(shù)

通過 T7 啟動子連在 oligo dT 引物上，可以在 cDNA 合成后啟動 IVT（in vitro transcription ），MARS-seq 2.0 是在 MARS-seq 基礎(chǔ)上，整合 index 分選以及大量平行單細(xì)胞 RNA測序方法，從而形成的一套流程。
徐5.jpg圖5. MARS-seq測序原理
 
單細(xì)胞測序技術(shù)發(fā)展前景
2013年，單細(xì)胞測序技術(shù)被《Nature Methods》評為年度技術(shù)。同年，《Science》將單細(xì)胞測序列為年度最值得關(guān)注的六大領(lǐng)域榜首。同時隨著技術(shù)發(fā)展更新，單細(xì)胞測序技術(shù)由早期的高成本、低通量及低自動化發(fā)展到目前的低成本、高通量、高自動化，臨床應(yīng)用得到飛速發(fā)展，能夠快速確定成千上萬個細(xì)胞的精確基因表達(dá)模式，分析每個細(xì)胞的遺傳異質(zhì)性。單細(xì)胞測序技術(shù)發(fā)展至今僅10余年，在神經(jīng)生物學(xué)、腫瘤研究、產(chǎn)前基因診斷等多個領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，早已成為科學(xué)研究領(lǐng)域當(dāng)之無愧的焦點。
 
參考文獻

 

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