小鼠小腸類器官的核心是隱窩干細胞。通過模擬腸道干細胞巢的微環(huán)境，實現(xiàn)在體外三維培養(yǎng)中的長期自我更新和分化。
小鼠小腸類器官培養(yǎng)步驟
小鼠小腸類器官的原代培養(yǎng)
樣本制備：小鼠斷頸處死，表面噴灑酒精殺菌。在無菌環(huán)境下截取出近胃端處3-15 cm腸組織，用鑷子小心去除腸道外部的腸系膜、脂肪，放入4℃預(yù)冷的含1%雙抗（60162ES）的DPBS（60154ES）溶液中。
樣本清洗：使用注射器沖洗腸道2-3次，用手術(shù)剪將腸管小心剪開，腸腔面朝上，手使用手術(shù)刀片輕輕刮去腸腔表面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后（呈現(xiàn)組織透明），將腸組織置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中清洗2-3次。
樣本初處理：將清洗后的小腸組織剪碎至2 mm寬大小塊狀體，順勢轉(zhuǎn)移至新的50 mL離心管（83508ES）中，用DPBS輕柔清洗3-5次，除去腸絨毛細胞和漂浮脂肪組織。
樣本消化：在清洗好的小腸碎片組織加入10-15 mL含有3-5 mM EDTA（60163ES）的預(yù)冷DPBS中消化，4℃孵育30 min左右，期間每10 min輕搖一次離心管。
消化完成后，棄去EDTA消化液上清，用新的DPBS緩沖液將組織輕柔漂洗2-3次以去除剩余的EDTA。
在小腸組織碎片中加入10-15 mL預(yù)冷的含0.1% BSA（36101ES）的DPBS，反復(fù)吹打、重懸組織碎片，使隱窩與基底層分離，然后取少許懸液鏡檢，當看有大量隱窩樣結(jié)構(gòu)后，停止吹打，并對吹打后的組織懸液使用70 μm濾網(wǎng)（84702ES）過濾并收集穿過濾網(wǎng)的組織懸液。
重復(fù)步驟5-6兩次，1500 rpm、4℃離心3 min。
混合物形成：用Ceturegel基質(zhì)膠（40192ES）重懸隱窩組織沉淀，每10 μL基質(zhì)膠懸液包含200-600個隱窩，重懸后混合液置于冰上，盡快操作以避免基質(zhì)膠形成凝膠。
注意：基質(zhì)膠稀釋比例≥ 50%以保證培養(yǎng)過程中Ceturegel基質(zhì)膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。
將混合懸液種植于24孔板底部正中央，每孔30-50 μL左右，避免懸液接觸孔板側(cè)壁。
將種植后的培養(yǎng)板至于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育30 min左右待基質(zhì)膠凝固。
待Ceturegel基質(zhì)膠完全凝固后，沿壁緩慢加入已配制好的腸類器官培養(yǎng)基，每孔800 μL。
將24孔板置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天更換一次新鮮培養(yǎng)基并監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，一般小鼠小腸類器官在5-7天內(nèi)形成。
小鼠小腸類器官的傳代
培養(yǎng)5-7天或小腸類器官中央變黑時可進行傳代，提前將12孔板（84012ES）或24孔板（84013ES）放于培養(yǎng)箱中孵育至少30 min。吸走待傳代的培養(yǎng)液，加1 mL/孔冷的DPBS，1 min后挑起基質(zhì)膠，用1 mL槍頭（83080ES）將基質(zhì)膠輕輕吹散，用注射器一次性吸走懸液，重復(fù)操作1次，將懸液加入5 mL離心管（83511ES）中，1200 rpm，4℃、5 min離心，棄上清，按每孔1∶3傳代。
小鼠小腸類器官的凍存
選擇生長狀態(tài)旺盛的類器官(一般傳代后3-4天)，進行凍存，每兩孔凍存一管。吸去培養(yǎng)液，加入1 mL細胞凍存培養(yǎng)液，用槍頭將加入類器官回收液的基質(zhì)膠吹散，后將懸液加到細胞凍存管（84105ES）中，放于凍存盒（84608ES）中，于-80℃冰箱放置1天，后轉(zhuǎn)入液氮長期保存。
小鼠小腸類器官的復(fù)蘇
將24孔板放于培養(yǎng)箱預(yù)熱30 min。取出液氮中的凍存管并置于37℃水浴鍋中，當凍存液溶解時取出，用1 mL注射器抽吸一次，然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管（83506ES）中，1200 rpm、4℃，離心5 min，棄上清，加入5 mL冰DPBS重懸，重復(fù)上述離心步驟，棄上清。按照類器官培養(yǎng)的步驟鋪板和培養(yǎng)。
小鼠小腸類器官培養(yǎng)結(jié)果
用光學顯微鏡觀察小鼠小腸類器官培養(yǎng)情況：
數(shù)據(jù)來源：Yeasen實驗室
結(jié)果顯示：小鼠小腸類器官三維立體，非扁平或彌散狀，囊腔完整，無破裂、無實性結(jié)節(jié)，在初始的囊狀結(jié)構(gòu)上，長出多個亮晶晶的、觸手狀的突起。
Yeasen產(chǎn)品推薦
HiActi細胞因子
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其他產(chǎn)品
翌圣生物
翌圣生物科技（上海）股份有限公司成立于2014年，是一家聚焦生命科學產(chǎn)業(yè)鏈上游核心原料，從事核苷酸、蛋白、細胞和類器官四大品類生物試劑的研發(fā)、生產(chǎn)與銷售的高新技術(shù)企業(yè)。公司兼?zhèn)浜诵募夹g(shù)自主研發(fā)和規(guī)?；a(chǎn)能力，核心產(chǎn)品數(shù)量達數(shù)千種，覆蓋分子克隆、qPCR、NGS、體外轉(zhuǎn)錄、抗體、蛋白純化及分析、細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、報告基因檢測和類器官等多種系列，廣泛應(yīng)用于生命科學研究、診斷檢測和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域。
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