重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）是Piepenburg等人在2006年利用重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和鏈置換DNA聚合酶等開(kāi)發(fā)出的一種新的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)能夠在10~30 min內(nèi)進(jìn)行恒溫（37~42℃）下的單分子核酸檢測(cè)，它具有反應(yīng)靈敏度高、特異性強(qiáng)、對(duì)儀器依賴(lài)程度低且可整合多種檢測(cè)模式等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于基層和現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)，可廣泛應(yīng)用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，有望成為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 替代方案。

RPA技術(shù)簡(jiǎn)介

RPA技術(shù)檢測(cè)方法

基礎(chǔ)型RPA檢測(cè)方案，僅需在反應(yīng)體系中加入一對(duì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳即可實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的判讀。

向基礎(chǔ)型RPA反應(yīng)體系中加入核酸外切酶Ⅲ(exonucleaseⅢ，exo)和exo熒光探針，或加入甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶(formamide pyrimidine DNA glycosylase，fpg)和fpg熒光探針，用熒光定量?jī)x來(lái)實(shí)時(shí)檢測(cè)RPA反應(yīng)。

1） exo探針?lè)ǎ涸赗PA的基礎(chǔ)上，加入了核酸外切酶III（exonuclease III，即exo）和exo熒光探針，核酸外切酶III會(huì)特異地切割熒光探針（THF位點(diǎn)），熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開(kāi)，發(fā)出熒光信號(hào)，通過(guò)熒光收集的儀器來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)控?zé)晒庵档淖兓?/span>

圖2. exo探針?lè)z測(cè)原理圖

2）fpg探針?lè)ǎ涸赗PA的基礎(chǔ)上，加入甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶（fpg）及fpg熒光探針，當(dāng)探針與模板結(jié)合時(shí)，fpg酶識(shí)別dR連接臂（dR group）并切割該位點(diǎn)，使得熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開(kāi)，發(fā)出熒光信號(hào)，通過(guò)熒光收集的儀器來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)控?zé)晒庵档淖兓?/span>

圖3. fpg探針?lè)z測(cè)原理圖

在RPA的基礎(chǔ)上，加入核酸外切酶Ⅳ（endonuclease Ⅳ，即nfo）、nfo探針和生物素標(biāo)記的反向引物。當(dāng)nfo探針與模板鏈互補(bǔ)時(shí)，核酸外切酶Ⅳ識(shí)別并切割THF殘基位點(diǎn)，擴(kuò)增獲得既有探針標(biāo)記物又有引物標(biāo)記物的擴(kuò)增子。然后加入對(duì)應(yīng)的標(biāo)記抗體，就能看到試紙條檢測(cè)線(xiàn)上的結(jié)果條帶。

圖4. NFO探針?lè)z測(cè)原理圖

翌圣RPA體系核心原料

電泳型RPA預(yù)混液部分?jǐn)?shù)據(jù)展示

翌圣RPA產(chǎn)品選擇指南

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