環(huán)介導等溫擴增（LAMP）是一種簡單而高效的DNA擴增檢測方法，以其快速、簡單等特點，在疾病診斷、轉(zhuǎn)基因食品檢測等分子POCT領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛。LAMP檢測方法分為多種，包括比濁法、pH顯色法、熒光染料法（如NHB、鈣黃綠素、SYBR Green、Syto等）、熒光探針法等，以上所有的方法都會用到關(guān)鍵核心酶原料Bst DNA聚合酶。

LAMP技術(shù)核心酶—Bst DNA聚合酶的性質(zhì)，包括聚合活性、鏈置換能力和穩(wěn)定性，在LAMP技術(shù)的反應(yīng)速度和準確性方面起著決定性的作用。

翌圣生物Hieff Bst Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）是將缺少5′→3′外切核酸酶結(jié)構(gòu)域的Thermophilic Geobacillus sp DNA聚合酶基因在E.coli中表達純化而得。該Bst DNA聚合酶鏈置換能力強，具備高靈敏度、高擴增效率、高dUTP耐受性的優(yōu)勢，可廣泛應(yīng)用于基于等溫擴增技術(shù)的病原體即時檢測。

Bst  Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）靈敏度超高，低至5copies目的基因可測。模板量為飛克（fg）級別，且始終能比競品更快達到閾值，擴增速率更快。

圖1. 分別用翌圣Bst  Plus DNA Polymerase（橙色）和競品N（灰色）、競品T（藍色）的Bst酶進行RT-LAMP反應(yīng)，使用各自制造商推薦的最佳方案，擴增新冠病毒。結(jié)果表明，翌圣Bst  Plus DNA Polymerase始終能比競品更快達到閾值，擴增速率更快。

使用Bst Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）進行RT-LAMP反應(yīng)，擴增新冠假病毒模板(20 copies/T)。在推薦反應(yīng)方案中引入dUTP/UDG酶防污染系統(tǒng)，使用dUTP替換dTTP。對比全U（35 mM）替換（紅色擴增曲線）與T：U = 1：1（藍色擴增曲線）的擴增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)體系中添加dUTP對Hieff Bst Plus DNA Polymerase的靈敏度及擴增效率無影響，該酶具有較高的dUTP耐受性。

圖2. 翌圣Hieff Bst Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）高dUTP耐受性驗證結(jié)果

翌圣生物持續(xù)專注于分子酶的改造研究，通過高通量篩選平臺獲得了Bst Plus DNA Polymerase，該酶以其優(yōu)異的靈敏度和抗抑制性能在新冠期間發(fā)揮重大作用。同時通過蛋白平臺的持續(xù)研發(fā)工作，開發(fā)了WS Bst DNA Polymerase（Cat#14412ES），該酶是在Bst Plus DNA 聚合酶的基礎(chǔ)上采用可逆性適配體修飾技術(shù)獲得的溫啟動等溫擴增聚合酶，能夠在室溫下完全封閉酶的活性，防止非特異性擴增，提高反應(yīng)效率，可在室溫下建立反應(yīng)，更適合高通量、大規(guī)模篩選場景。另外，該溫啟動Bst聚合酶不需要單獨的激活步驟，在>60℃時1min內(nèi)完全釋放酶活。

使用溫啟動Bst酶（Cat#14412ES）配置的RT-LAMP預(yù)混液16729（藍色）、16730（無甘油，黑色），和市面上同類產(chǎn)品Supplier A（紅色）同時擴增，結(jié)果顯示：在不同體系下，16729/16730的擴增性能與Supplier A無顯著差異，且特異性更好。

圖3. 使用14412ES配置的LAMP體系與同類產(chǎn)品擴增性能比較

使用溫啟動Bst酶（Cat#14412ES）配置成熒光染料法的LAMP試劑，選擇特異性一般的貓細小病毒引物，進行LAMP擴增，結(jié)果顯示：適配體修飾的溫啟動Bst酶能在室溫下抑制反應(yīng)的進行，顯示為本底信號低，非特異性擴增出峰時間晚于無適配體修飾的Bst酶在常溫和冰上配置的體系。

圖4. 使用14412ES配置的LAMP體系與無適配體修飾的Bst酶配置的體系室溫建立反應(yīng)比較

目前LAMP反應(yīng)推薦溫度為60-65℃，在該溫度下，存在靶標核酸模板變性不徹底，樣本中存在的抑制劑難以被滅活等問題，從而可能造成模板利用率不高或模板被降解等現(xiàn)象，最終導致LAMP檢測靈敏度受限。為了獲得適用于更高溫度LAMP/RT-LAMP實驗的Bst DNA聚合酶，翌圣與蘇州醫(yī)工所和華東理工三方聯(lián)合，通過ProStaB/FADS的高通量雙功能酶分子改造平臺，共同開發(fā)了耐熱Bst DNA聚合酶 Super Bst DNA Polymerase(Cat#14410ES/14411ES)，提升了Bst DNA聚合酶在70℃高溫RT-LAMP中的擴增性能，可為期望提升LAMP實驗靈敏度和開發(fā)免提取LAMP/RT-LAMP產(chǎn)品的客戶提供測試裝。

通過改造Bst DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性，相比Parent（母本），突變體Bst22的Tm值提高了2.9℃，且耐熱Bst22酶（Cat#14410ES）搭配高溫耐熱MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Yeasen Cat#14612ES）能耐受70℃高溫RT-LAMP反應(yīng)。

圖5.耐熱Bst DNA聚合酶突變體篩選

以gDNA為模板，搭配翌圣13762的buffer體系，考察14411在65℃和70℃的擴增能力。圖a添加量為2ng/uL的模板，圖b模板濃度梯度降低，結(jié)果表明：14411可耐受70℃的LAMP反應(yīng)，且提高溫度，檢測Ct值顯著縮小，表明耐熱Bst酶可進一步提升體系的靈敏度。

圖6. Bst酶14411靈敏度測試

Bst DNA聚合酶對比