隨著我國(guó)集約化、規(guī)模化養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，動(dòng)物疫病的流行情況日益復(fù)雜，多病原混合感染頻發(fā)，且公共衛(wèi)生安全事件時(shí)有發(fā)生，“人病獸防”的關(guān)口前移顯得尤為重要。傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)雖然常用，但單次檢測(cè)數(shù)量有限，難以應(yīng)對(duì)未知病原、突變體及復(fù)雜的混合感染。
在此背景下，中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)分會(huì)發(fā)布了《動(dòng)物病原微生物高通量靶向測(cè)序技術(shù)（擴(kuò)增法）規(guī)范專家共識(shí)（2025版）》，旨在為基于多重PCR擴(kuò)增法的靶向高通量測(cè)序技術(shù)（tNGS）在獸醫(yī)臨床的應(yīng)用提供統(tǒng)一、規(guī)范的指導(dǎo)。以下是對(duì)該共識(shí)核心內(nèi)容的深度解讀：
1
什么是tNGS？
它的核心優(yōu)勢(shì)在哪？
tNGS全稱為高通量靶向測(cè)序，它通過(guò)靶向富集目標(biāo)病原體基因來(lái)提高檢測(cè)的敏感性和準(zhǔn)確性。
共識(shí)特別聚焦于多重PCR擴(kuò)增法。與探針捕獲法相比，擴(kuò)增法具有成本更低、速度更快、操作流程更簡(jiǎn)單、起始樣本量要求更少的顯著優(yōu)勢(shì)，因此極其適合在基層和獸醫(yī)臨床中大范圍推廣使用。
它不僅能快速獲取病原的序列信息，還能實(shí)現(xiàn)溯源分型、鑒定以及人獸共患病的排查。
2
好鋼用在刀刃上
tNGS的五大關(guān)鍵應(yīng)用場(chǎng)景
共識(shí)明確指出了獸醫(yī)臨床中強(qiáng)烈建議使用tNGS的5種關(guān)鍵場(chǎng)景，并劃定了一個(gè)“不建議”的紅線：
聚集性暴發(fā)且常規(guī)檢測(cè)低效時(shí)：當(dāng)出現(xiàn)聚集性發(fā)病，常規(guī)快檢無(wú)法迅速鎖定病原時(shí)。
急需耐藥性評(píng)估時(shí)：傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)太慢，可直接用tNGS檢測(cè)病原及其耐藥基因（注意耐藥基因檢出與樣本細(xì)菌載量正相關(guān)）。
需確認(rèn)特殊毒力表型時(shí)：高度懷疑某病原具有高毒力，需要測(cè)序來(lái)精準(zhǔn)捕捉毒力基因。
臨床表現(xiàn)與常規(guī)檢測(cè)結(jié)果不符時(shí)：懷疑存在復(fù)雜的混合感染或需明確病原亞型。
處理高污染或高宿主細(xì)胞樣本時(shí)：例如肺泡灌洗液（宿主細(xì)胞多）或糞便（污染重），此時(shí)tNGS的抗干擾能力和敏感性遠(yuǎn)優(yōu)于宏基因組測(cè)序（mNGS）。
不建議的場(chǎng)景：如果常規(guī)檢查容易確診且經(jīng)驗(yàn)性治療有效的普通感染，不建議濫用tNGS，也不建議用它來(lái)簡(jiǎn)單評(píng)估抗感染治療的效果。
3
嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室“準(zhǔn)入門檻”
與防污染機(jī)制
高通量測(cè)序極其靈敏，且可能涉及高致病性病原，因此共識(shí)制定了嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室操作底線：
生物安全：必須具備生物安全二級(jí)（BSL-2）及以上條件。
布局規(guī)范：明確要求設(shè)置7個(gè)功能區(qū)（樣品接收、試劑準(zhǔn)備、樣品制備、擴(kuò)增、文庫(kù)構(gòu)建、質(zhì)檢測(cè)序、數(shù)據(jù)分析），核心目的是防止擴(kuò)增產(chǎn)物交叉污染導(dǎo)致的“假陽(yáng)性”。
質(zhì)量驗(yàn)證：要求實(shí)驗(yàn)室對(duì)自建方法進(jìn)行準(zhǔn)確性、敏感性、重復(fù)性及檢出限（LOD）的嚴(yán)格驗(yàn)證。
4
tNGS的成敗在于引物組（Panel）。共識(shí)對(duì)引物組的設(shè)計(jì)提出了規(guī)范：
長(zhǎng)度控制： 擴(kuò)增子建議在 100-200 bp，以適應(yīng)降解樣本。
內(nèi)容豐富： 不僅要有物種鑒定基因，還要包含耐藥基因、毒力基因和高突變監(jiān)測(cè)基因（如疫苗株與流行株的鑒別）。
低干擾： 強(qiáng)調(diào)引物間及靶點(diǎn)間的同源性避讓，防止互相干擾。
5
標(biāo)準(zhǔn)化操作
從樣本到數(shù)據(jù)的“全鏈條”質(zhì)控
為確保結(jié)果準(zhǔn)確，共識(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行了細(xì)化：
圖1 實(shí)驗(yàn)基本流程
樣本采集：根據(jù)檢測(cè)目的選擇直接相關(guān)的樣本進(jìn)行采集，并做好無(wú)菌以及防止交叉污染的措施。
提取策略的靈活選擇：根據(jù)疑似病原類型，靈活選擇DNA策略（針對(duì)細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)、DNA病毒）、RNA策略（針對(duì)RNA病毒）或DNA+RNA共檢策略（針對(duì)混合感染）。
核酸質(zhì)量評(píng)估：共識(shí)對(duì)樣本質(zhì)量確定了A、B、C類三個(gè)不同等級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)估。具體參照下表：
表1 進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建的DNA 樣品類別選擇標(biāo)準(zhǔn)
DNA樣品類別 | 是否滿足文庫(kù)構(gòu)建 |
A類 | 滿足文庫(kù)構(gòu)建要求，DNA 總量≥100 ng |
B類 | 滿足文庫(kù)構(gòu)建要求，DNA 總量≥10 ng，且<100 ng |
C 類 | 不完全滿足文庫(kù)構(gòu)建要求，可以嘗試進(jìn)行該步驟，但不保證測(cè)序質(zhì)量。建議重新采樣，重新提取樣品DNA |
表2 進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建的RNA 樣品類別選擇標(biāo)準(zhǔn)
RNA樣品類別 | 是否滿足文庫(kù)構(gòu)建 |
A類 | 滿足文庫(kù)構(gòu)建要求，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 總量≥100 ng |
B類 | 滿足文庫(kù)構(gòu)建要求，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 總量≥10 ng，且<100 ng |
C 類 | 不完全滿足文庫(kù)構(gòu)建要求，可以嘗試進(jìn)行該步驟，但不保證測(cè)序質(zhì)量。建議重新采樣，重新提取樣品RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 |
數(shù)據(jù)質(zhì)控指標(biāo)：下機(jī)數(shù)據(jù)必須滿足極高的質(zhì)量要求，即大于Q20的堿基比例≥90%，大于Q30的堿基比例≥80%。且分?jǐn)偟矫總€(gè)樣本的原始數(shù)據(jù)量不能低于 3 M。
6
結(jié)果判定的“金標(biāo)準(zhǔn)”
與專業(yè)解讀的重要性
測(cè)序出數(shù)據(jù)只是第一步，如何“拍板”定性是臨床最關(guān)心的環(huán)節(jié)。共識(shí)給出了極具參考價(jià)值的經(jīng)驗(yàn)性閾值：
陽(yáng)性判定：所有病原靶標(biāo)序列數(shù) ≥ 1000條，特定病原序列數(shù) ≥ 100條，且陰性對(duì)照無(wú)檢出。
可疑判定：特定病原序列數(shù)在 20-100條 之間，建議復(fù)測(cè)。
陰性判定：特定病原未檢出或少于20條。但共識(shí)強(qiáng)調(diào)，不能單憑陰性結(jié)果就絕對(duì)排除感染，必須結(jié)合臨床綜合判斷。
特別提示： tNGS如果檢出高致病性或重要人獸共患病原，無(wú)論序列數(shù)多少，都必須引起高度重視并用其他方法復(fù)核。
此外，測(cè)序報(bào)告必須由具備生物信息學(xué)知識(shí)和獸醫(yī)專業(yè)背景的人員進(jìn)行解讀，盲目根據(jù)報(bào)告用藥極易導(dǎo)致抗微生物藥物的濫用。
7
從“實(shí)驗(yàn)室技術(shù)”走向“臨床利器”： 共識(shí)要求報(bào)告時(shí)間在 48-72 小時(shí)內(nèi)完成，這符合臨床對(duì)疫病診斷的時(shí)效性要求。
提升診斷質(zhì)量： 強(qiáng)制要求建立“實(shí)驗(yàn)室基線數(shù)據(jù)庫(kù)”和“陰性對(duì)照文庫(kù)”，極大降低了因環(huán)境污染導(dǎo)致的誤診率。
推動(dòng)“人病獸防”： 強(qiáng)調(diào)了對(duì)人獸共患病病原的監(jiān)測(cè)，體現(xiàn)了“同一健康（One Health）”的理念，提升了獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室在公共衛(wèi)生安全中的地位。
規(guī)范化解讀： 要求由具備生物信息學(xué)知識(shí)和獸醫(yī)專業(yè)背景的人員共同審核報(bào)告，防止由于盲目解讀數(shù)據(jù)而導(dǎo)致的抗生素濫用。
《動(dòng)物病原微生物高通量靶向測(cè)序技術(shù)（擴(kuò)增法）規(guī)范專家共識(shí)（2025版）》的發(fā)布，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)獸醫(yī)檢測(cè)行業(yè)在該領(lǐng)域規(guī)范性標(biāo)準(zhǔn)的空白。它不僅是一份操作指南，更是提升我國(guó)動(dòng)物疫病“檢測(cè)-監(jiān)測(cè)-預(yù)警”整體水平的重要基石，對(duì)保障養(yǎng)殖業(yè)降本增效和國(guó)家公共衛(wèi)生安全具有深遠(yuǎn)的戰(zhàn)略意義。
翌圣生物病原tNGS建庫(kù)系列產(chǎn)品推薦
產(chǎn)品類別 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) |
DNA&RNA共提取 | MolPure Magnetic Pathogen DNA/RNA Kit | 18306ES |
MolPure Mag BL Pathogen DNA/RNA Kit | 18307ES | |
逆轉(zhuǎn)錄一步法多重?cái)U(kuò)增 | Hieff Multiplex RT-PCR Kit | 12950ES |
多重?cái)U(kuò)增建庫(kù) | 4× Hieff Multiplex PCR Master Mix | 12948ES |
2× Hieff NGS HG Multiplex PCR Master Mix | 13283ES | |
4× Hieff Multiplex PCR Master Mix 2.0 | 12977ES | |
逆轉(zhuǎn)錄 | Hieff NGS 1st cDNA Synthesis Mix | 12958ES |
Hieff NGS 1st cDNA Synthesis Kit | 12946ES | |
Hieff NGS 1st Strand Synthesis Kit | 12249ES | |
三代測(cè)序建庫(kù) | Hieff DNA Library Prep Kit for ONT （ONT平臺(tái)三代建庫(kù)試劑盒） | 13301ES |
翌圣生物
翌圣生物科技（上海）股份有限公司成立于2014年，是一家聚焦生命科學(xué)產(chǎn)業(yè)鏈上游核心原料，從事核苷酸、蛋白、細(xì)胞和類器官四大品類生物試劑的研發(fā)、生產(chǎn)與銷售的高新技術(shù)企業(yè)。公司兼?zhèn)浜诵募夹g(shù)自主研發(fā)和規(guī)模化生產(chǎn)能力，核心產(chǎn)品數(shù)量達(dá)數(shù)千種，覆蓋分子克隆、qPCR、NGS、體外轉(zhuǎn)錄、抗體、蛋白純化及分析、細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、報(bào)告基因檢測(cè)和類器官等多種系列，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究、診斷檢測(cè)和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域。
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