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第二期主題：脫鹽柱

緩沖液置換的原理是凝膠過濾層析的組分分離 (Group Separation) ：超過填料排阻極限的生物大分子，因?yàn)闊o(wú)法進(jìn)入填料孔隙中，而排阻在外，緊跟著外水體積（30%柱體積）Z先出峰；而小分子則依據(jù)其分子量大小，會(huì)不同程度的進(jìn)入填料孔隙中，晚出峰，從而將大分子和小分子雜質(zhì)分開。常用于樣品準(zhǔn)備、層析步驟之間的銜接、去除染料或小分子標(biāo)記物、終止反應(yīng)、去除核苷酸以及脂質(zhì)體包封率的檢測(cè)^[1/2]等。脫鹽本身即是一種緩沖液置換，將樣品從高鹽緩沖液置換到低鹽或無(wú)鹽緩沖液。

Sephadex G系列填料，為葡聚糖交聯(lián)還原氯丙烷（即異表氯醇）。目前Sephadex系列產(chǎn)品主要用于組分分離，如緩沖液置換。Sephadex G系列填料的不同數(shù)字（G-10、G-15、G-25、G-50、G-75和G-100），代表其使用不同分子量范圍的葡聚糖，G后面數(shù)字越小，葡聚糖共聚物的交聯(lián)度越高，分離樣品的分子量范圍越小。另外，隨著交聯(lián)度的增加，填料的溶脹降低。 

G系列填料對(duì)于球蛋白、多糖和DNA樣品的分離范圍請(qǐng)參考表1和表2。其中，G-25Z為常用，適合目的樣品分子量大于5 KD^[4]。緩沖液置換要求目的樣品的分子量大于排阻極限（可以參考分離范圍的上限），也就是無(wú)法進(jìn)入填料孔隙中，同時(shí)，雜質(zhì)小分子Z好低于分離范圍的下限，在接近1個(gè)柱體積位置出峰，對(duì)于G-10和G-15建議Z好小于100 Da。

根據(jù)樣品分子量、體積和操作方式，選擇合適的脫鹽柱產(chǎn)品。

HiTrap系列 (5 mL) ，可以注射器、蠕動(dòng)泵或?KTA儀器操作，Z多5根串聯(lián)。更大體積連接?KTA儀器使用的HiPrep系列 (15 mL) ，Z多4根串聯(lián)。

例如HiTrap串聯(lián)后，上樣量隨著柱體積而增加，反壓增加需適當(dāng)降低流速，但是分辨率也稍好^[6]：    

當(dāng)需要處理更大體積樣品時(shí)，也可以購(gòu)買散裝填料自行裝填空柱。粗顆粒 (Coarse) 反壓低、流速較快，細(xì)顆粒 (Fine) 流速較慢但分辨率較高。一般，選擇裝填高度較矮 (10~30 cm) 且直徑大的柱子^[4]，以提高流速縮短運(yùn)行時(shí)間。

G系列填料裝填方法請(qǐng)參考產(chǎn)品操作說(shuō)明^[12/13]，溶脹后粒徑大小如下，可以用于評(píng)估柱效：

不同形式的預(yù)裝脫鹽柱和填料的對(duì)應(yīng)關(guān)系如下：

PD-10脫鹽柱（貨號(hào)17085101）預(yù)先裝填了8.3 mL的Sephadex G-25 M填料，頂端和底端各有一片燒熔的聚乙烯多孔濾板（孔徑20-85 μm），確保填料在重力流的作用下不至于流干。PD-10空柱體積為13.5 mL，可以購(gòu)買LabMate PD-10 Buffer Reservoir儲(chǔ)液槽將空柱的體積增加25 mL，使得平衡、wash等在一步內(nèi)完成（無(wú)需反復(fù)多次補(bǔ)充緩沖液）。 

手動(dòng)脫鹽的效果：通常，PD系列手動(dòng)脫鹽柱的脫鹽效率在85~90%以上，樣品回收率在70%~95%以上（依據(jù)樣品性質(zhì)而定）^[6]。

作為一種分子篩，脫鹽應(yīng)用中的Z關(guān)鍵的影響因素是樣品體積（而非樣品量）。例如，PD-10柱床體積是8.3 mL，推薦Z大上樣體積8.3 mL*30%（外水體積）≈2.5 mL，重力操作的典型出峰情況如圖4^[8]。平衡柱子后，上2.5 mL樣品（注意這個(gè)時(shí)候流出的是之前的平衡緩沖液，無(wú)需收集），之后加3.5 mL buffer趕出目的樣品，即在2.5~6 mL進(jìn)行收集，洗脫體積一共為3.5 mL。

HiTrap Desalting 5 mL，推薦上樣體積1.5 mL。超過該范圍繼續(xù)增加上樣體積，峰展寬和面積增加，蛋白峰和鹽峰之間的交叉變多，分辨率降低^[4]。根據(jù)收集樣品體積的不同，將損失樣品回收率或純度。

為了確保脫鹽效率，可以降低上樣體積至15-20%柱體積^[4]，但手動(dòng)操作時(shí)可能需要補(bǔ)足體積而造成樣品被進(jìn)一步稀釋，此時(shí)也可以考慮多次重復(fù)過柱脫鹽。

一般，樣品濃度對(duì)于脫鹽無(wú)顯著影響。樣品濃度和流動(dòng)相之間的粘度系數(shù) (Viscosity) 在1.5倍以內(nèi)即可，對(duì)于常規(guī)的水溶性緩沖液，基本對(duì)應(yīng)于蛋白濃度在70 mg/mL^[4]以下，但通常建議蛋白濃度低于30 mg/mL；高分子量聚合物如多糖建議濃度在5 mg/mL以內(nèi)^[4]；DNA樣品在1 mg/mL以內(nèi)^[9]。另外，注意樣品充分溶解且穩(wěn)定、無(wú)聚集沉淀、不過于粘稠而造成峰形拖尾。上樣前注意用0.45 μm或0.22 μm濾膜過濾或離心（15,000×g, 15 min）去除顆粒^[4]。

脫鹽柱對(duì)于部分復(fù)雜樣品同樣適用，如HiPrep 26/10 Desalting用于10 mL小鼠血漿（10,000 g離心10 min后）樣品^[4]以及畢赤酵母表達(dá)重組蛋白的發(fā)酵上清（0.45 um濾膜過濾）^[6]。

Sephadex填料的強(qiáng)度和pH穩(wěn)定性，根據(jù)其交聯(lián)程度而有差異。以Sephadex G-25為例^[6]，在常用的緩沖液中穩(wěn)定，如8 M尿素、6 M鹽酸胍以及離子和非離子型去污劑。低濃度的醇類（如甲醇、乙醇、異丙醇）可以用于緩沖液或樣品中，推薦濃度低于25 v/v%。避免超過推薦pH范圍或使用氧化劑。操作條件下pH穩(wěn)定區(qū)間在2~13。測(cè)試中，暴露于0.1 M HCl中1~2小時(shí)或0.02 M HCl中6個(gè)月，不影響填料性能。甚至可以儲(chǔ)存于0.01 M NaOH中（功能改變需自行測(cè)試）^[11]。案例中，PD-10脫鹽柱可以去除蛋白樣品中的DTT或碘乙酰胺。對(duì)于尿素的去除，建議逐步降低緩沖液中尿素的濃度并設(shè)置梯度進(jìn)行多次換液，避免蛋白變性沉淀。 

PD-10脫鹽柱等手動(dòng)脫鹽產(chǎn)品，均設(shè)計(jì)為一次性使用，理論上不建議重復(fù)操作。但是，當(dāng)多次操作之間的交叉污染不是關(guān)注點(diǎn)時(shí)，可以少次重復(fù)使用。仍然建議用于同一種樣品，并檢測(cè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。可以參考HiPrep 26/10 Desalting的清潔操作^[4]如下：

優(yōu)先推薦堿洗，注意交聯(lián)度更低的G-50~G-100在進(jìn)行堿洗時(shí)，請(qǐng)將填料移出柱管，避免填料體積膨脹。Sephadex G-25使用0.2 M NaOH進(jìn)行60~90 min的清潔和消毒，之后使用水或緩沖液沖洗，可以耐受上百次循環(huán)處理^[6]。另外，Sephadex可以在120度 (pH 7.0) 高壓濕熱滅菌^[12/6]。 

Sephadex  G-25干粉填料，建議儲(chǔ)存在4~30度。裝柱前參考表1量取填料（建議按照Z(yǔ)小溶脹體積計(jì)算，量取盡可能多的填料）并溶脹后使用，或者直接購(gòu)買預(yù)裝柱，保存前水洗，儲(chǔ)存在20%乙醇或10 mM NaOH^[11]中，4~30度，不要冷凍。 

DNA樣品的脫鹽推薦illustra系列產(chǎn)品，如NAP-5/10/25。NAP柱子中的填料是Sephadex G-25 Superfine, DNA grade（即DNase free），經(jīng)過測(cè)試，保證重復(fù)性和DNA樣品的高回收率，基本無(wú)非特異性吸附?？梢耘抛鑯10 bp以上的DNA片段。更小體積 (25–100 μl) 的核酸脫鹽，可以嘗試illustra MicroSpin S-200, S-300 and S-400 HR產(chǎn)品。   

B站視頻：如何使用離心法對(duì)PD系列脫鹽柱進(jìn)行操作

參考文獻(xiàn)