在自然環(huán)境中，絕大多數(shù)微生物難以通過常規(guī)培養(yǎng)方法成功分離。無論是環(huán)境功能菌群，還是深海、腸道等復(fù)雜或極端生態(tài)位中的微生物，“未培養(yǎng)”或“難培養(yǎng)”狀態(tài)始終是制約功能解析與應(yīng)用轉(zhuǎn)化的核心瓶頸。傳統(tǒng)研究路徑依賴“培養(yǎng)—篩選—測序”，但在實際應(yīng)用中往往面臨兩方面限制：一是許多關(guān)鍵功能微生物在脫離原生環(huán)境后迅速喪失活性，甚至無法存活；二是真正承擔(dān)特定代謝功能的細(xì)胞通常豐度極低，群體平均方法難以準(zhǔn)確捕獲其真實貢獻(xiàn)。因此，在不依賴培養(yǎng)的前提下，于原位狀態(tài)直接識別、定位并解析功能微生物，成為當(dāng)前研究的重要需求。

 近年來，拉曼光譜、穩(wěn)定同位素標(biāo)記（如 D₂O、13C）與可視化單細(xì)胞分選技術(shù)的發(fā)展，使研究者能夠在復(fù)雜體系中直接獲取單細(xì)胞層面的代謝表型，并基于表型判據(jù)進(jìn)行精準(zhǔn)分離，為未/難培養(yǎng)微生物的原位研究提供了可行的技術(shù)路徑。圍繞這一研究范式，長光辰英構(gòu)建了以PRECI SCS-R300 拉曼單細(xì)胞分選儀與 Scatcher Ultra 單細(xì)拉曼光鑷操縱與分選儀為核心的平臺方案，系統(tǒng)性支持未培養(yǎng)/難培養(yǎng)微生物的原位識別、分選與后續(xù)解析。

在活性污泥體系中，真正承擔(dān) BPA降解功能的細(xì)菌通常豐度極低，且難以通過傳統(tǒng)平板分離獲得。研究中引入 13C-BPA 穩(wěn)定同位素標(biāo)記，結(jié)合單細(xì)胞拉曼光譜，在不破壞原生體系的條件下直接識別攝取并代謝 BPA 的活性細(xì)胞。

隨后，通過 PRECI SCS-R300 可視化拉曼分選，將這些“原位標(biāo)記”的單細(xì)胞精準(zhǔn)分離，用于后續(xù)基因組與功能分析，從而實現(xiàn)對 BPA 降解菌的免培養(yǎng)原位捕獲。

圖1：雙酚A降解菌的拉曼原位識別與分選捕獲流程示意圖^[1]

02 土壤原生解磷菌的原位活性檢測

土壤中解磷菌（PSB）在農(nóng)業(yè)養(yǎng)分循環(huán)中具有重要意義，但其活性狀態(tài)高度依賴微環(huán)境，離體培養(yǎng)往往難以真實反映其功能。

通過 D₂O 重水標(biāo)記，研究者可在土壤原生體系中直接標(biāo)記代謝活躍的解磷細(xì)胞，并利用拉曼光譜對單細(xì)胞層面的代謝活性進(jìn)行判定。結(jié)合可視化單細(xì)胞分選技術(shù)，實現(xiàn)對原生土壤環(huán)境中真實活性 PSB 的定向獲取，為功能菌研究提供更加可靠的原位證據(jù)。

圖2：重水拉曼標(biāo)記篩選土壤活性解磷菌流程圖^[2]

03 功能微生物的定向培養(yǎng)新策略

針對未知培養(yǎng)條件的功能微生物，研究者提出了“先識別，再培養(yǎng)”的反向思路。通過拉曼-13C同位素技術(shù)在復(fù)雜體系中篩選具備特定代謝特征的單細(xì)胞，并利用 PRECI SCS-R300 （或 Scatcher Ultra 拉曼光鑷系統(tǒng)）完成精準(zhǔn)分離，隨后結(jié)合單細(xì)胞基因組信息反向設(shè)計培養(yǎng)條件，實現(xiàn)對難培養(yǎng)功能菌的精準(zhǔn)篩選與培養(yǎng)突破。

圖3 單細(xì)胞拉曼分選-穩(wěn)定同位素示蹤-反向基因組學(xué)（RACS-SIP-GDC） 技術(shù)路徑示意圖^[3]

04 深海微生物的免培養(yǎng)原位檢測

深海環(huán)境樣品極其珍貴，且微生物往往無法耐受常規(guī)實驗操作。

利用 Scatcher Ultra 單細(xì)胞拉曼光鑷操縱與分選儀，實現(xiàn)液體原位固定與單細(xì)胞拉曼檢測。研究者可在不依賴培養(yǎng)的情況下，直接對深海微生物的代謝特征進(jìn)行分析，光鑷操縱技術(shù)對目標(biāo)細(xì)胞的溫和操控與分離，為深海微生物的功能研究提供了一條低擾動、免培養(yǎng)的原位研究路徑。

圖4. 光鑷?yán)Y(jié)合深度學(xué)習(xí)的深海微生物原位識別結(jié)果^[4]

05 腸道微生物的原位解析與厭氧單細(xì)胞培養(yǎng)

腸道微生物群中大量關(guān)鍵成員屬于嚴(yán)格厭氧、難培養(yǎng)類群。通過多模態(tài)成像、拉曼表型識別與可視化單細(xì)胞分選，研究者可在保持細(xì)胞活性的前提下，對目標(biāo)腸道微生物進(jìn)行精準(zhǔn)定位與分離；進(jìn)一步結(jié)合微陣列與厭氧培養(yǎng)體系，實現(xiàn)從原位識別 → 單細(xì)胞分選 → 活體培養(yǎng) → 測序驗證的閉環(huán)研究流程。

圖5 熒光探針標(biāo)記腸道微生物分選擴(kuò)增測序(FLCiSS)流程圖^[5]

^{圖6 厭氧菌單細(xì)胞分選培養(yǎng)與擴(kuò)增和測序驗證}