在2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》中，血液制品（Blood Products）被定義為源自人類血液或血漿的治療產(chǎn)品，例如人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子等。

就我國(guó)血制品當(dāng)下的狀況而言，通常所說(shuō)的血制品主要是指血漿蛋白制品。人血漿里，血漿蛋白質(zhì)占比達(dá)7~8%，其含量處于60~80g/L 之間。如今，人們已經(jīng)知曉，人血漿中包含大約200多種各具獨(dú)特生物功能的血漿蛋白質(zhì)成分。

為了高效利用珍貴的血漿資源，現(xiàn)代工業(yè)已具備對(duì)20多種血漿蛋白成分進(jìn)行分離純化的能力。在經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的病毒滅活處理之后，能夠制造出各類血液制品。這些制品在臨床預(yù)防和治療各種疾病方面安全性出色、有效性高、療效確切，是其他藥物所無(wú)法替代的。

血液制品市場(chǎng)需求十分旺盛，迫切需要加大純化生產(chǎn)的力度。當(dāng)前已有多種純化技術(shù)被應(yīng)用于血液制品的分離純化流程之中。其中，低溫乙醇法仍是血漿蛋白分離規(guī)?；a(chǎn)的根基。不過(guò)隨著分離工藝的持續(xù)演進(jìn)，層析技術(shù)的重要性愈發(fā)凸顯，在層析技術(shù)里應(yīng)用最為廣泛的當(dāng)屬離子交換層析介質(zhì)和親和層析介質(zhì)。

目前常用的純化方法

低溫乙醇法

低溫條件下，不同蛋白在不同濃度乙醇中溶解度不同，通過(guò)改變乙醇濃度、溫度、pH值可得不同組分，沉淀后離心，所得的上清與沉淀可再重復(fù)以上操作。

離子交換層析

離子交換層析根據(jù)不同蛋白帶電性的差異進(jìn)行純化。在血漿經(jīng)除鹽處理或乙醇冷沉后的組分，以適宜的pH值、離子強(qiáng)度流經(jīng)離子交換填料，通過(guò)改變?nèi)芤簵l件（pH、鹽濃度）吸附與洗脫蛋白，從而達(dá)到分離的目的。大多數(shù)血液制品均可試用離子交換層析。離子交換層析在去除內(nèi)毒素方面具有優(yōu)勢(shì)。

親和層析

親和層析根據(jù)生物分子間特異性吸附原理分離蛋白。目的蛋白可經(jīng)偶聯(lián)特異性配基（例如肝素、賴氨酸、明膠等）的填料純化，帶有Fc-tag或含抗體成分的血漿蛋白可使用Protein A親和填料，高純度與高收率二者兼得。

凝膠過(guò)濾層析

凝膠過(guò)濾層析根據(jù)蛋白分子量的差異純化蛋白，常用于血漿蛋白分離第一步脫鹽，以及最后一步精純的過(guò)程中，可顯著去除HAV病毒（Hepatitis A virus, HAV ）。

擴(kuò)張床層析

擴(kuò)張床層析兼具流化床與固定床的特點(diǎn)。根據(jù)待分離組分，按特定流速自下而上流經(jīng)層析柱，小分子流穿，隨后通過(guò)調(diào)節(jié)溶液流速、pH、鹽濃度等條件，依次洗脫相對(duì)分子質(zhì)量及電荷不同的各組分，達(dá)到先分層后分離的效果。

層析技術(shù)的應(yīng)用，從根本上改善了血液制品步驟繁瑣、分離時(shí)間長(zhǎng)、分離效果差、自動(dòng)化程度低等缺點(diǎn)，有效地提高了原料血漿的利用率及產(chǎn)品質(zhì)量，豐富了產(chǎn)品的種類。

以下是低溫乙醇法結(jié)合層析工藝制備各類血漿蛋白的工藝總覽圖：

Fig.1 低溫乙醇法結(jié)合層析工藝制備各類血漿蛋白工藝總覽圖

各類血漿蛋白層析方案

四代靜丙層析工藝

免疫球蛋白（IgG）是血液中除白蛋白外最豐富的蛋白，占血液總免疫球蛋白的75%，是與體液免疫應(yīng)答相關(guān)的主要免疫球蛋白。其作為參與機(jī)體對(duì)抗感染的主要分子，具有與病原體或毒素結(jié)合、激活補(bǔ)體、加強(qiáng)吞噬作用的殺傷作用，并具有啟動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)和減輕移植器官排斥的能力，是臨床應(yīng)用中使用最廣泛的免疫球蛋白。

人IgG分子量150kD，等電點(diǎn)5.8~7.3。靜脈注射人免疫球蛋白（靜丙）產(chǎn)品經(jīng)過(guò)多代發(fā)展，制備工藝不斷改進(jìn)，以往第三代靜丙工藝采用低溫乙醇法結(jié)合陰離子層析進(jìn)行，IgA、凝集素等雜質(zhì)含量高，容易引起臨床不良反應(yīng)。

目前國(guó)內(nèi)企業(yè)自主研發(fā)的第四代靜丙產(chǎn)品，純化工藝采用低溫乙醇法結(jié)合2步陰離子+抗A、抗B血凝素親和層析進(jìn)行。多步層析有效提高產(chǎn)品純度，吸附去除AIbumin（白蛋白）、IgA、IgM和抗A、抗B血凝素，降低過(guò)敏反應(yīng)和溶血風(fēng)險(xiǎn)；制備過(guò)程病毒去除/滅活采用辛酸沉淀+低pH孵育+20nm納濾，充分保證病毒安全性。

第四代靜丙純化第一步層析推薦采用博格隆Diamond Q強(qiáng)陰離子交換層析填料。面對(duì)血漿這類粘稠料液，該填料壓力流速表現(xiàn)依然優(yōu)秀，可放大性高，載量接近200mg/mL左右，收率＞95%。

Fig.2 四代靜丙層析工藝流程

人凝血酶原復(fù)合物（PCC）和人凝血因子Ⅸ層析工藝

人凝血酶原復(fù)合物（Prothrombin Complex Concentrate，PCC）是幾種凝血因子的復(fù)合物。PCC主要含有4種維生素K依賴的凝血因子，即凝血酶原（FⅡ）、抗乙型血友病因子（FⅨ）、凝血酶原（FⅩ）和凝血酶原轉(zhuǎn)化因子（FⅦ）。因此PCC被廣泛用于治療凝血因子（FⅡ、FⅦ、FⅨ和FⅩ）獲得性缺乏相關(guān)疾病。目前PCC的工業(yè)純化方式主要為從去冷沉淀血漿中采用低溫乙醇法結(jié)合陰離子層析進(jìn)行純化。

人凝血因子Ⅸ為參與人體內(nèi)源性凝血過(guò)程非常重要的一種蛋白。當(dāng)血漿中人凝血因子Ⅸ含量或活性大幅下降時(shí)，將導(dǎo)致人體無(wú)法進(jìn)行正常的凝血，從而引發(fā)B型血友病。

人血Ⅸ因子分子量56kD，等電點(diǎn)＞5。一般從去冷沉淀血漿中采用層析工藝進(jìn)行制備，先經(jīng)過(guò)DEAE A50凝膠吸附Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ凝血因子，換液后推薦使用博格隆Diamond DEAE弱陰離子交換層析填料，采用結(jié)合洗脫模式，低鹽洗雜除去結(jié)合力弱的部分雜質(zhì)凝血因子，隨后提高鹽濃度洗脫得到Ⅸ因子粗品。粗純液中經(jīng)過(guò)超濾或者透析換液后進(jìn)行S/D處理，滅活病毒。之后利用博格隆Heparin Bestarose FF肝素親和填料進(jìn)行純化，洗脫產(chǎn)品比活力＞110IU/mg。

Fig.3 （PCC）和人凝血因子Ⅸ層析工藝流程

抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）層析工藝

抗凝血酶ATⅢ是人體內(nèi)最重要的生理性抗凝蛋白，約占抗凝系統(tǒng)總活性的70%，參與維持體內(nèi)凝血與抗凝系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡。

肝素鈉可以與ATⅢ結(jié)合，從而增強(qiáng)后者對(duì)活化的Ⅱ、Ⅸ、X、Ⅺ和Ⅻ凝血因子的抑制作用。因此，目前ATⅢ普遍利用肝素親和填料從采用低溫乙醇法制備的Ⅰ上清或者Ⅳ沉淀進(jìn)行純化，一步層析既可得到較高純度的ATⅢ產(chǎn)品。

Fig.4 （ATⅢ）層析工藝流程

C1酯酶抑制劑層析工藝

C1酯酶抑制劑對(duì)補(bǔ)體、纖溶、凝血、激肽四大系統(tǒng)都有抑制作用，承擔(dān)了體內(nèi)90%的FVIIa滅活作用。目前工業(yè)化的制備方案可以從去冷沉淀血漿中采用離子+疏水填料進(jìn)行純化。

具體制備方案為以去冷沉淀血漿為原料，首先可采用博格隆 CM Bestarose FF弱陽(yáng)離子交換層析填料進(jìn)行初步純化，隨后使用Phenyl Bestarose FF(HS)疏水層析填料進(jìn)行進(jìn)一步純化，純化樣品經(jīng)過(guò)脫鹽后采用巴氏消毒和納米膜過(guò)濾去除病毒，經(jīng)過(guò)配制、除菌過(guò)濾和凍干后得到成品。

Fig.5 C1酯酶抑制劑層析流程

人血清白蛋白層析工藝

人血清白蛋白是人血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，占血漿總蛋白的50~60%，濃度達(dá)38~48g/L，是人體血漿中最主要的蛋白質(zhì)，維持機(jī)體營(yíng)養(yǎng)與滲透壓，在機(jī)體中具有重要的生理功能。

HSA（Human Serum Albumin, HSA）屬于一種單鏈無(wú)糖基化蛋白質(zhì)，組成為585個(gè)氨基酸，分子量是66.5kD，等電點(diǎn)介于4.7~4.9。1946年，Cohn等公開(kāi)發(fā)表了低溫乙醇分離白蛋白工藝，被稱為Cohn 6法。1962年，瑞士紅十字會(huì)的Kistler和Nitschmann對(duì)低溫乙醇法進(jìn)行改進(jìn)，建立了Kistler-Nitschmann法。此后，人血白蛋白的制備工藝不斷發(fā)展，層析技術(shù)和壓濾技術(shù)使白蛋白的純度和收率得到提高，病毒滅活工藝的加入確保了人血白蛋白的病毒安全性。

Blue Bestarose FF是博格隆推出的白蛋白親和層析填料，是一種以瓊脂糖為基架，Cibacron Blue 3GA為配基的親和介質(zhì)，具有物理及化學(xué)性能穩(wěn)定、配基不易脫落、使用壽命長(zhǎng)、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。這種介質(zhì)不僅能通過(guò)特異的相互作用與蛋白質(zhì)結(jié)合，也可以通過(guò)電荷以及疏水等作用與蛋白質(zhì)進(jìn)行非特異性結(jié)合。

Blue Bestarose FF已被廣泛應(yīng)用于各種蛋白質(zhì)的分離純化領(lǐng)域，如脫氫酶、激酶、轉(zhuǎn)移酶、血清白蛋白、干擾素及血漿蛋白等，可以特異性結(jié)合白蛋白，用于血漿來(lái)源的白蛋白或重組白蛋白的捕獲。

其他血漿蛋白層析工藝

人凝血Ⅷ因子的制備：采用冷沉淀為原料，經(jīng)過(guò)Tris緩沖液抽提后，利用氫氧化鋁凝膠或者粉末進(jìn)行吸附，經(jīng)過(guò)S/D處理后采用合適的陰離子填料進(jìn)行純化，洗脫液經(jīng)過(guò)處理后得到終產(chǎn)品。

人纖維蛋白原的制備：可以利用Ⅷ因子制備過(guò)程中陰離子步驟洗出組分為原料，采用Lys親和填料純化纖維蛋白原。

重組血漿蛋白層析工藝

重組血漿蛋白產(chǎn)品目前發(fā)展迅速，臨床上重要的凝血因子如Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ等，其重組產(chǎn)品產(chǎn)量已經(jīng)超過(guò)血源產(chǎn)品。對(duì)于重組類血漿蛋白的純化，例如Fc融合Ⅷ因子，其層析工藝可以參考抗體純化，可采用Protien A親和+陰離子+陽(yáng)離子/疏水層析。

博格隆的填料在Fc融合Ⅷ因子項(xiàng)目上有豐富的臨床放大案例。如果構(gòu)建有His標(biāo)簽可采用Ni親和填料進(jìn)行純化。對(duì)于不含標(biāo)簽的重組類產(chǎn)品，可以采用離子+疏水+復(fù)合層析的策略進(jìn)行。

結(jié)語(yǔ)

血液制品的市場(chǎng)需求極為強(qiáng)勁，當(dāng)下迫切需要大力提升其純化生產(chǎn)的強(qiáng)度與效率。目前，已有眾多純化技術(shù)被廣泛應(yīng)用于血液制品的分離純化工作流程之中。在這些技術(shù)里，低溫乙醇法仍是血漿蛋白分離實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)的重要基石。然而，隨著分離工藝的不斷發(fā)展與進(jìn)步，層析技術(shù)的關(guān)鍵地位日益突顯。

在層析技術(shù)的各類應(yīng)用當(dāng)中，離子交換介質(zhì)和親和層析介質(zhì)的應(yīng)用范圍最為廣泛。博格隆精心研發(fā)并推出了一系列高效能的層析產(chǎn)品，致力于為血液制品行業(yè)打造堅(jiān)實(shí)可靠的解決方案，全力協(xié)助相關(guān)企業(yè)在產(chǎn)品質(zhì)量提升與生產(chǎn)效率提高等方面取得更大突破與進(jìn)展。

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