光子橋接在激光掃描顯微鏡中使用雙光子激發(fā)的顯著優(yōu)勢源于吸收取決于激發(fā)強(qiáng)度的平方的基本物理原理。實(shí)際上，雙光子激發(fā)是通過顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)聚焦單個(gè)脈沖激光產(chǎn)生的。隨著激光束被聚焦，光子變得更加擁擠（它們的空間密度增加），并且其中兩個(gè)同時(shí)與單個(gè)熒光團(tuán)相互作用的概率增加。

       光子橋接激光焦點(diǎn)是光子上光子密集到足以產(chǎn)生大量雙光子激發(fā)的唯 一 位置。 說明了在顯微鏡焦點(diǎn)處的含熒光團(tuán)樣品中雙光子激發(fā)的產(chǎn)生。在焦點(diǎn)之上，光子密度不足以讓兩個(gè)光子同時(shí)在單個(gè)熒光團(tuán)的吸收截面內(nèi)通過。然而，在焦點(diǎn)處，光子間隔非常近，以至于可以在單個(gè)熒光團(tuán)的吸收截面內(nèi)同時(shí)找到其中的兩個(gè)。 

       在實(shí)踐中，光子橋接雙光子激發(fā)顯微鏡不僅可以通過在空間上集中光子（通過顯微鏡光學(xué)器件的聚焦），而且還可以通過時(shí)間集中（通過利用來自鎖模激光器的脈沖）來實(shí)現(xiàn)。組合效應(yīng)允許為雙光子激發(fā)產(chǎn)生必要的光子強(qiáng)度，但 10 × E(-5) 的脈沖占空比（脈沖持續(xù)時(shí)間除以脈沖之間的時(shí)間）將平均輸入功率限制為小于 10毫瓦，僅比共聚焦顯微鏡中使用的略大。盡管激光脈沖持續(xù)時(shí)間被認(rèn)為是超短的，通常在大約 100 飛秒和 1 皮秒之間（10 × E(-13) 到 10 × E(-12) 秒），與大約 10 × E 的熒光團(tuán)吸收事件相比(-18) 秒，雙光子激發(fā)對照明焦點(diǎn)的狹窄定位是該技術(shù)優(yōu)于共聚焦顯微鏡的Z顯著優(yōu)勢的基礎(chǔ)。在共焦顯微鏡中，雖然在整個(gè)樣本照明體積中激發(fā)了熒光，但只有源自焦平面的信號(hào)才能通過共焦針孔，從而可以收集無背景數(shù)據(jù)。

       相比之下，雙光子激發(fā)僅在焦平面上產(chǎn)生熒光，并且由于不產(chǎn)生背景熒光，因此不需要針孔。共焦和雙光子激發(fā)顯微鏡的激發(fā)區(qū)域之間的這種巨大差異可以通過對每種方法的光漂白模式進(jìn)行成像來證明。說明了在熒光素染色的 Formvar 薄膜中重復(fù)掃描單個(gè) xy 平面（圖像平面）在 xz 方向上出現(xiàn)的光漂白圖案。共聚焦系統(tǒng)的激光激發(fā)焦平面上方和下方的熒光團(tuán) ，導(dǎo)致在這些廣泛區(qū)域中觀察到的漂白。相比之下，雙光子激發(fā)僅發(fā)生在焦平面，因此漂白僅限于該區(qū)域 。

圖3 - 單光子和雙光子激發(fā)

雙光子顯微技術(shù)中激發(fā)的局部化產(chǎn)生了許多有利的效果。也許Z重要的是，雙光子激發(fā)顯微鏡的三維分辨率與理想共聚焦顯微鏡的分辨率相同。此外，由于離焦標(biāo)本區(qū)域沒有吸收，更多的激發(fā)光穿過標(biāo)本到達(dá)焦平面。結(jié)果是大大增加了樣品穿透力，通常是共聚焦顯微鏡的兩到三倍。利用雙光子激發(fā)（如圖 3 所示）的另一個(gè)好處是Z 大限度地減少光漂白和光損傷 - 活細(xì)胞和組織的熒光顯微鏡中的兩個(gè)Z嚴(yán)重的限制。雖然與光相互作用引起的細(xì)胞損傷知之甚少，但很明顯，減少光損傷將導(dǎo)致被研究的生物標(biāo)本的生存能力延長。來自實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的證據(jù)是，單獨(dú)的紅色激發(fā)光不會(huì)影響細(xì)胞活力，并且可能觀察到的大部分光損傷與雙光子吸收有關(guān)，因此僅限于焦平面。

兩光子激發(fā)顯微鏡不需要針孔來獲得三維分辨率，從而可以靈活地檢測幾何形狀。雙光子激發(fā)的去掃描和非去掃描檢測的幾何結(jié)構(gòu)如圖 4 所示。在去掃描的幾何結(jié)構(gòu)中，發(fā)射光（以藍(lán)色表示）沿著與激發(fā)光相同的路徑返回，在通過之前撞擊掃描鏡通過共焦針孔到達(dá)檢測器（圖 4（a））。在共聚焦顯微鏡中，必須利用這種幾何形狀來消除對離焦發(fā)射的檢測。非消掃描光束路徑提供更多配置選擇：共軛平面檢測器布置在物鏡之后立即放置一個(gè)二向色鏡（圖 4（b），并將發(fā)射的光通過轉(zhuǎn)移透鏡反射到放置在與物鏡后孔共軛的平面上的檢測器；發(fā)射的光可以由外部檢測器收集直接來自樣品，不通過物鏡（圖 4(c)；或發(fā)射光被二向色反射器轉(zhuǎn)向到中間像平面的電荷耦合器件 (CCD) 相機(jī)，以獲得寬場圖像（圖 4（d））后一種幾何結(jié)構(gòu)適用于采用雙光子激發(fā)的快速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)。

盡管可以對雙光子激發(fā)使用去掃描檢測，但為了充分利用這種技術(shù)的深度穿透，建議使用非去掃描替代方案（外部檢測器）。非退掃描路徑能夠收集更多散射光子，需要更少的光學(xué)元件，例如鏡子和透鏡，并減少路徑長度，空氣中的灰塵顆粒會(huì)干擾熒光信號(hào)。因此，使用具有雙光子激發(fā)的非去掃描檢測方法可顯著提高收集效率，并且對于Z 大深度滲透到活組織中是必不可少的。