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HEK293殘留DNA片段分析Kit，輕松實(shí)現(xiàn)HCD片段大小質(zhì)控

來源：翌圣生物科技(上海)股份有限公司 更新時(shí)間：2024-12-25 14:38:30 閱讀量：140

 

HEK293細(xì)胞應(yīng)用及其殘留DNA質(zhì)控
 
HEK293細(xì)胞是一種人胚腎細(xì)胞系，因其對(duì)生長(zhǎng)和培養(yǎng)環(huán)境要求不高、易于轉(zhuǎn)染，以及相比于常用的CHO細(xì)胞翻譯后修飾（PTM）能力更為強(qiáng)大的特點(diǎn)，目前在工業(yè)內(nèi)也被廣泛用于抗體蛋白生產(chǎn)、疫苗中的病毒樣顆粒生產(chǎn)、細(xì)胞和基因治療中的病毒載體生產(chǎn)等領(lǐng)域。但也有實(shí)驗(yàn)證明，HEK293注入裸鼠中可成瘤，所以HEK293宿主細(xì)胞殘留成分是生物制品質(zhì)量控制中一個(gè)重要環(huán)節(jié)，需要被控制在可接受的水平。

 

嚴(yán)格的純化工藝可以去除一部分宿主細(xì)胞DNA（HCD）等殘留雜質(zhì)成分，但產(chǎn)品中仍然可能會(huì)有HCD殘留，這些殘留的外源宿主細(xì)胞DNA會(huì)引發(fā)潛在的安全問題（如潛在致瘤性、傳染性，甚至增加免疫源性或?qū)е峦蛔儯?，所以HCD檢測(cè)項(xiàng)目是生物制品生產(chǎn)工藝中重要的質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)之一。

 

殘留DNA風(fēng)險(xiǎn)及法規(guī)監(jiān)管要求
 
WHO和各國(guó)藥物注冊(cè)監(jiān)管機(jī)構(gòu)均對(duì)生物制品中外源宿主DNA殘留提出了監(jiān)測(cè)和控制要求，以確保生物制品的安全性及質(zhì)量可控性。

 

WHO和美國(guó)FDA現(xiàn)行指導(dǎo)方針推薦成品中殘留DNA不高于10 ng/劑，美國(guó)FDA還指出生物制品宿主細(xì)胞DNA殘留DNA不高于100 pg/劑。歐洲藥典通則規(guī)定生物制品殘留DNA限度大多為不超過10 ng/劑。中國(guó)藥典2020年版三部規(guī)定，以細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)的生物制劑外源宿主細(xì)胞DNA殘留量不能超過100 pg/劑，以細(xì)菌或真菌基質(zhì)生產(chǎn)的疫苗DNA殘留量不能超過10 ng/劑。

 

除需對(duì)DNA的殘留量進(jìn)行控制外，DNA殘留片段大小分布也是確定其相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素的重要指標(biāo)。有研究表明，一個(gè)功能基因至少在200bp以上，因此大于200bp有可能會(huì)有一定的致病性，而且殘留DNA片段越大，生物制品的風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)越高。DNA片段大小對(duì)應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)如下表：

 

DNA片段大小風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)劃分

注：風(fēng)險(xiǎn)程度依據(jù)風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)遞增

美國(guó)FDA在《Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs) 》行業(yè)指南中建議將非致瘤性連續(xù)細(xì)胞的殘留DNA量限制在10 ng/劑以下，DNA大小限制在約200bp以下。

 

2022年5月，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品評(píng)審中心（CDE）發(fā)布的體內(nèi)基因治療產(chǎn)品要學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）中也明確指出，需對(duì)DNA殘留量和殘留片段大小進(jìn)行控制，建議盡量將DNA殘留片段的大小控制在200bp以下。
 

 

殘留DNA片段分析方法
 

目前，檢測(cè)宿主細(xì)胞殘留DNA含量的方法都相對(duì)成熟，而且藥典法規(guī)也有明確規(guī)定，如《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版第三部規(guī)定，外源性DNA殘留檢測(cè)采用DNA探針雜交法、熒光染料色法和定量PCR法

然而，關(guān)于殘留DNA片段大小的檢測(cè)與分析，目前還沒有特定推薦的方法。

目前，行業(yè)內(nèi)對(duì)于殘留宿主細(xì)胞DNA片段分析，主要是利用毛細(xì)管電泳的方法。研究者們開發(fā)了一種基于毛細(xì)管凝膠電泳與敏感激光誘導(dǎo)熒光（CGE-LIF）檢測(cè)殘留DNA分子大小的方法，可以檢測(cè)生物制品中殘留DNA的大小，實(shí)驗(yàn)表明，大多數(shù)宿主細(xì)胞殘留DNA片段大小為50-2000bp。除了毛細(xì)管電泳法外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）法也被用于進(jìn)行生物制品中生產(chǎn)用細(xì)胞相關(guān)的DNA片段分布的分析。且qPCR法相比于CGE-LIF操作更簡(jiǎn)單，耗時(shí)更短。

針對(duì)上述情況，翌圣生物自主研發(fā)了HEK293殘留DNA片段分析試劑盒，采用熒光探針qPCR法原理，設(shè)計(jì)了四種不同的擴(kuò)增片段（82bp、133bp、227bp、515bp），用于定量檢測(cè)樣本中HEK293宿主細(xì)胞殘留DNA片段的大小分布情況。樣本類型包括：慢病毒上清液、腺相關(guān)病毒AAV上清液、HEK293細(xì)胞裂解液等。還研發(fā)了與之配套使用的宿主細(xì)胞殘留DNA樣本前處理試劑盒，以及配套的自動(dòng)化核酸提取儀器。

 

HEK293殘留DNA片段分析Kit產(chǎn)品性能

符合法規(guī)：按照Chp、USP、ICH等要求進(jìn)行全面驗(yàn)證，性能符合中外法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)；
保障品質(zhì)：試劑盒原材料全自主研發(fā)，qPCR Mix等酶產(chǎn)品在超潔凈酶工廠生產(chǎn)；
配合審計(jì)：保障試劑盒生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，批間差可控，有完善的審計(jì)文件；
靈敏度高：定量限可達(dá)10fg/μL水平；
專屬性強(qiáng)：特異性檢測(cè)HEK293細(xì)胞殘留DNA，不受其他外源基因組DNA干擾；
防干擾強(qiáng)：添加UDG酶，消化常規(guī)產(chǎn)物氣溶膠污染，防止非特異性擴(kuò)增
 

產(chǎn)品信息

 

產(chǎn)品

貨號(hào)

品名

規(guī)格

樣本前處理試劑盒

18461ES

MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒（瓶裝）

25T/100T

18462ES

MolPure® Mag32 Residual DNA Sample Preparation Kit FA磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒FA（預(yù)封裝）

2×16T/6×16T

核酸提取儀器

80501ES

Auto-Pure 32A automated nucleic acid extraction system Auto-Pure 32A全自動(dòng)核酸提取儀

32通量

殘留DNA片段分析試劑盒

41316ES

HEK293 Host Cell Residue DNA Size Analysis Kit HEK293 宿主細(xì)胞殘留 DNA 片段分析試劑盒

4×50T/4×100T

 

參考文獻(xiàn)

[1]《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心，2022年5月。
[2] 閆璐瑤等，宿主細(xì)胞殘留DNA片段大小分布檢測(cè)方法的建立及驗(yàn)證[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2021年3月第34卷第3期。
[3] U.S. FDA. Guidance for Industry: Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs).

 

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