在生命科學中，過去人們認為基因組的核苷酸序列決定生物遺傳特征，而表觀遺傳學發(fā)現(xiàn)，核苷酸序列不變時生物表型也能穩(wěn)定遺傳，這一機制影響著發(fā)育、疾病等關鍵生命過程。DNA 甲基化是研究最深入的表觀遺傳修飾，指在特定酶催化下，以 S - 腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉移到 DNA 特定堿基上的過程，它能調(diào)控基因 “開啟” 或 “關閉”，對生理過程很重要，因此精準檢測 DNA 甲基化狀態(tài)，對探索生命機制、解析疾病機理、尋找診斷標志物等都有關鍵意義，是推動相關領域發(fā)展的重要支撐。

圖1. 胞嘧啶甲基化的過程

在DNA 甲基化修飾中，以下三種甲基化模式最為常見：

• Dam甲基化：在GATC序列中腺嘌呤N6位發(fā)生甲基化。

• Dcm甲基化：在CCAGG和CCTGG序列中第2個胞嘧啶C5位發(fā)生甲基化。

• CpG甲基化：CpG甲基轉移酶將甲基轉移到C殘基的C5位置。（真核生物DNA的CpG甲基化是分布最為廣泛的一類甲基化修飾模式）。

圖2. Dam、Dcm、CpG甲基化示意圖

甲基化敏感內(nèi)切酶：檢測 DNA 甲基化的關鍵工具

在明確 DNA 甲基化檢測對生命科學與醫(yī)學研究的關鍵價值后，如何高效、精準地實現(xiàn)對 DNA 甲基化狀態(tài)的分析便成為核心需求，而甲基化敏感限制性內(nèi)切酶正是滿足這一需求的重要工具。這類酶具有特殊的識別特性，它們能精準識別 DNA 鏈上特定的堿基序列，卻會因這些序列中堿基是否發(fā)生甲基化而表現(xiàn)出不同的切割活性。

對于甲基化敏感的內(nèi)切酶而言，當甲基化位點與限制性內(nèi)切酶識別序列發(fā)生重疊，酶切會受到阻斷或影響，可分為兩種情況：

甲基化敏感的內(nèi)切酶能夠直接區(qū)分 DNA 片段的甲基化狀態(tài)，為后續(xù)通過凝膠電泳、PCR 擴增等技術分析特定基因區(qū)域的甲基化水平奠定了基礎。

目前，利用甲基化敏感內(nèi)切酶對基因組 DNA 序列進行識別與切割，是研究單個位點甲基化水平的常用策略。基于這一策略發(fā)展出的技術包括：甲基敏感的限制性內(nèi)切酶 PCR、甲基敏感的限制性內(nèi)切酶 qPCR、簡化基因組重亞硫酸鹽測序（RRBS）、甲基化敏感性的限制酶測序（MRE-Seq）。下文將深入解析這些技術的原理及優(yōu)勢，為科研選擇提供參考。

甲基敏感的限制性內(nèi)切酶 PCR（Methyl-Sensitive Restriction Enzymes PCR）是發(fā)展較早的甲基化檢測技術，其原理清晰易懂：

• 若 DNA 位點為低甲基化狀態(tài)，對應的酶切位點可被甲基敏感限制性內(nèi)切酶切開，經(jīng)過 PCR 擴增后，與對照組相比，擴增產(chǎn)物的條帶會消失或亮度顯著變暗；

• 若 DNA 位點為高甲基化狀態(tài)，對應的酶切位點無法被酶切開，經(jīng)過 PCR 擴增后，與對照組相比，擴增產(chǎn)物的條帶亮度基本一致。

基于這一原理，科研人員可通過凝膠電泳的結果，快速判斷目標位點的甲基化水平高低。該技術具有操作簡單、實驗成本低、結果直觀易觀察的優(yōu)勢，在早期甲基化研究中應用廣泛。

圖3. 甲基敏感的限制性內(nèi)切酶PCR流程^[1]

在甲基敏感的限制性內(nèi)切酶 PCR方法的基礎上發(fā)展出更精確的甲基化定量分析，即使用熒光定量PCR（qPCR）對酶切后的底物進行檢測。其原理：

因此，位點甲基化程度越高，可供PCR擴增的DNA模板就越多，在qPCR中就越早檢測到DNA擴增（即Ct值越低）。通過 Ct 值的差異，可實現(xiàn)對甲基化水平的精準定量，為甲基化研究提供更精確的數(shù)據(jù)支持。

圖4. 限制酶消化的特定甲基化位點分析^[1]

簡化基因組重亞硫酸鹽測序（RRBS）的核心原理是通過 “亞硫酸鹽處理 + 靶向測序” 實現(xiàn)甲基化位點的高效檢測。首先用限制性內(nèi)切酶切割基因組 DNA，富集含 CpG 位點的特定片段并構建文庫；隨后用亞硫酸鹽處理這些 DNA 片段，使未甲基化的胞嘧啶（C）轉化為尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶（5mC）保持不變；最后通過高通量測序獲取序列信息，將測序結果與參考基因組對比，若原 C 位點測序結果為 C，則說明該位點發(fā)生甲基化，若為 T（U 在 PCR 擴增中轉化為 T），則為未甲基化，從而精準定位并量化基因組中特定區(qū)域的甲基化狀態(tài)。

由于RRBS通過特異性限制性內(nèi)切酶對基因組中CpG富集區(qū)域進行分析，大大減少了所需測序數(shù)據(jù)量，僅需10–300 ng樣本量即可有效和準確分析，具有時間和成本效益，該技術對 DNA 樣本的 input 質(zhì)量要求較低，適用范圍更廣。

圖5.RRBS原理概述^[2]

MRE-seq 的實驗流程如下：首先利用多種甲基化敏感限制性內(nèi)切酶（如 HpaII 等）對基因組 DNA 進行掃描，這類酶僅能特異性切割未發(fā)生甲基化的 CpG 位點；隨后將酶切產(chǎn)物合并，通過分選獲得目標片段，依次進行末端修復反應與單核苷酸接頭連接，經(jīng) PCR 擴增及產(chǎn)物純化后，即可上機開展測序（圖 6）。將測序結果與參考基因組進行比對后，可通過分析未被切割的 CpG 位點信息，進一步轉化得到基因組特定位點的甲基化水平。

作為一種具備單CpG 分辨率的 DNA 甲基化分析技術，MRE-Seq 尤其適合低 CpG 密度區(qū)域的甲基化檢測。但該技術也存在一定局限性：一方面，其檢測范圍依賴于特定限制酶的識別序列，基因組中酶切位點的分布直接決定了檢測覆蓋范圍，存在覆蓋盲區(qū)；另一方面，實驗過程中可能出現(xiàn)的不完全酶切現(xiàn)象，可能導致部分假陽性結果，對實驗準確性造成影響。

圖6. MRE-Seq原理概述^[2]

除上述四種核心技術外，基于 “甲基化敏感酶識別切割基因組 DNA 序列” 原理發(fā)展的甲基化檢測方法還有很多，例如差異甲基化雜交技術（DMH）、熒光甲基化檢測技術（LUMA）、連接介導 PCR 富集 HpaII 微小片段技術（HELP）等。這些技術各有特點，在甲基化分析與檢測領域中發(fā)揮著重要作用，為科研人員提供了多樣化的工具選擇，助力深入探索 DNA 甲基化模式。

作為中國分子酶領域的領軍企業(yè)，翌圣生物成功攻克了限制性內(nèi)切酶研發(fā)的 “卡脖子” 難題。針對表觀遺傳學研究需求，我們整理了以下常見甲基化敏感限制性內(nèi)切酶選擇指南，幫助科研人員無縫替換進口酶 —— 無需改變現(xiàn)有實驗流程，即可獲得一致甚至更優(yōu)的酶切效果。

除以上常用限制性內(nèi)切酶產(chǎn)品，翌圣現(xiàn)有超100種限制性內(nèi)切酶，滿足超90%常用需求。掃描下方二維碼，即可獲取翌圣限制性內(nèi)切酶全系產(chǎn)品資料，文件包含：貨號、產(chǎn)品名稱、酶活、切割位點、buffer兼容活性等信息。

參考文獻：

[1] Khulan B, Thompson RF, Ye K, Fazzari MJ, Suzuki M, Stasiek E, Figueroa ME, Glass JL, Chen Q, Montagna C, Hatchwell E, Selzer RR, Richmond TA, Green RD, Melnick A, Greally JM. Comparative isoschizomer profiling of cytosine methylation: the HELP assay. Genome Res. 2006 Aug;16(8):1046-55. 

[2] Li S, Tollefsbol TO. DNA methylation methods: Global DNA methylation and methylomic analyses. Methods. 2021 Mar;187:28-43.

翌圣生物

翌圣生物科技（上海）股份有限公司成立于2014年，是一家聚焦生命科學產(chǎn)業(yè)鏈上游核心原料，從事核苷酸、蛋白、細胞和類器官四大品類生物試劑的研發(fā)、生產(chǎn)與銷售的高新技術企業(yè)。公司兼?zhèn)浜诵募夹g自主研發(fā)和規(guī)?；a(chǎn)能力，核心產(chǎn)品數(shù)量達數(shù)千種，覆蓋分子克隆、qPCR、NGS、體外轉錄、抗體、蛋白純化及分析、細胞培養(yǎng)、轉染、報告基因檢測和類器官等多種系列，廣泛應用于生命科學研究、診斷檢測和生物醫(yī)藥等領域。