蜂產(chǎn)品中雙甲脒及其代謝物殘留量的測(cè)定

參考GB 31657.8-2025 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 蜂產(chǎn)品中雙甲脒及其代謝物殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》

本方案適用蜂蜜和蜂王漿雙甲脒和2,4-二甲基苯胺的測(cè)定。

(1) 雙甲脒和2,4-二甲基苯胺混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：由迪馬科技標(biāo)準(zhǔn)品部提供(Cat.#: 48872)，濃度為100μg/mL溶于乙腈。

(2) 雙甲脒和2,4-二甲基苯胺混合標(biāo)準(zhǔn)中間液Ⅰ：準(zhǔn)確吸取適量雙甲脒和2,4-二甲基苯胺混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用50%乙腈水配制成標(biāo)準(zhǔn)中間液Ⅰ，濃度為5.0μg/mL。

(3) 雙甲脒和2,4-二甲基苯胺混合標(biāo)準(zhǔn)中間液Ⅱ：準(zhǔn)確吸取適量雙甲脒和2,4-二甲基苯胺混合標(biāo)準(zhǔn)中間液Ⅰ，用50%乙腈水配制成標(biāo)準(zhǔn)中間液Ⅱ，濃度為125ng/mL。

(4) 雙甲脒和2,4-二甲基苯胺混合標(biāo)準(zhǔn)中間液Ⅲ：準(zhǔn)確吸取適量雙甲脒和2,4-二甲基苯胺混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用50%乙腈水配制成標(biāo)準(zhǔn)中間液Ⅲ，濃度為1.0μg/mL。

(5) 雙甲脒和2,4-二甲基苯胺混合標(biāo)準(zhǔn)中間液Ⅳ：準(zhǔn)確吸取適量雙甲脒和2,4-二甲基苯胺混合標(biāo)準(zhǔn)中間液Ⅲ，用50%乙腈水配制成標(biāo)準(zhǔn)中間液Ⅳ，濃度為25ng/mL。

蜂蜜：

(1) 稱取5g樣品于50mL塑料離心管中；

(2) 向離心管中加入5mL 0.2mol/L磷酸氫二鉀溶液；

(3) 向離心管中加入5mL乙腈，振蕩5min；

(4) 向離心管中加入5g氯化鈉和5g無水硫酸鎂，立即搖勻，振蕩5min；

(5) 冷水浴5min；

(6) 8000rmp離心5min；

(7) 移取上清液至另一個(gè)離心管中待凈化。

蜂王漿：

(1) 稱取2g樣品于50mL塑料離心管中；

(2) 向離心管中加入2mL 0.2mol/L磷酸氫二鉀溶液；

(3) 向離心管中加入10mL乙腈，振蕩5min；

(4) 向離心管中加入3g氯化鈉和3g無水硫酸鎂，立即搖勻，振蕩5min；

(5) 冷水浴5min；

(6) 8000rmp離心5min；

(7) 移取上清液至另一個(gè)離心管中待凈化。

ProElut PMR 150mg/3mL (Cat.#: 65996)

樣品：準(zhǔn)確吸取2mL待凈化液于PMR小柱，接收流出液，吸取流出液0.5mL于2mL玻璃進(jìn)樣瓶(Cat.#: 1033)，加入0.5mL水，混勻，經(jīng)0.22μm PTFE濾膜過濾(Cat.#: 37178)，待測(cè)定。

基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作液： 準(zhǔn)確吸取2mL空白樣品待凈化液于PMR小柱，接收流出液，吸取流出液0.5mL于2mL玻璃進(jìn)樣瓶(Cat.#: 1033)，加入適量標(biāo)準(zhǔn)中間液，用水定容至1mL，混勻，經(jīng)0.22μm PTFE濾膜過濾(Cat.#: 37178)，待測(cè)定。

UPLC條件

色譜柱：Leapsil C18，100 x 4.6mm，2.7μm (Cat.#: 86002)

流速：0.3mL/min

進(jìn)樣量：10μL

柱溫：35℃

流動(dòng)相：A:0.1%甲酸水溶液  B:甲醇

質(zhì)譜條件

電離模式: ESI

掃描方式: 正離子掃描

檢測(cè)方式: 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)

電噴霧電壓: 4500V

霧化氣壓力: 50psi

輔助氣壓力: 50psi

氣簾氣壓力: 20psi

離子源溫度: 500℃

1. 液相條件為反向條件下，2,4-二甲基苯胺在普通C18色譜柱上保留很弱，在50%乙腈水的溶劑條件下，洗脫能力太強(qiáng)，容易有溶劑效應(yīng)，經(jīng)過測(cè)試，使用我司色譜柱Leapsil C18，100 x 4.6mm，2.7μm (Cat.#: 86002)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)目標(biāo)物有較好的保留，并且能消除溶劑效應(yīng)。

2. 蜂王漿樣品除了比蜂蜜樣品有更強(qiáng)的基質(zhì)影響，在進(jìn)樣過程中，還有更快的代謝速率。代謝速率測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蜂王漿在等待進(jìn)樣過程中，每過1小時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生2%的代謝物，蜂蜜產(chǎn)生0.5%的代謝物，建議自動(dòng)進(jìn)樣器設(shè)置低溫，降低雙甲脒代謝速率。

3. 本方法在原方法基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化，使用磷酸氫二鉀替換了磷酸二氫鉀，降低了代謝中間產(chǎn)物的不穩(wěn)定性，提升了回收率，加標(biāo)回收結(jié)果的重現(xiàn)性更好。

4. ProElut PMR凈化小柱對(duì)樣品中的脂類有很強(qiáng)的選擇性吸附，同時(shí)不吸附目標(biāo)物。兩種添加水平的蜂王漿樣品的基質(zhì)效應(yīng)從24.8%、16.4%分別提升到55.6%、40.4%，除了降低基質(zhì)效應(yīng)的效果非常明顯，上樣后，小柱上也殘留有色雜質(zhì)，見下圖：