異形胞（heterocyst）某些絲狀藍(lán)藻（如束毛藻、魚(yú)腥藻、念珠藻等）所特有的變態(tài)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，是由普通營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞在一定的條件下尤其是氮素營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)分化而成。異形胞一般與營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞同形，單個(gè)地間生，一條藻絲上往往有數(shù)個(gè)異形細(xì)胞。異形胞與營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài)區(qū)別是：個(gè)體大，細(xì)胞壁厚，細(xì)胞質(zhì)中的顆粒物質(zhì)溶解成顆粒狀態(tài)，顏色呈淡黃綠色或呈透明狀。

而為關(guān)鍵的生理功能區(qū)別有兩點(diǎn)：

l 異形胞能進(jìn)行固氮作用，在其高含量固氮酶的催化下，將空氣中的N₂轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>NH₃，NH⁴⁺，進(jìn)而形成氨基酸。

l 異形胞藻膽素含量顯著低于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。

正是基于這兩點(diǎn)，則引出了科學(xué)家的兩點(diǎn)疑惑：

l 早期研究證實(shí)，藍(lán)藻在固氮過(guò)程中也是存在光合放氧的，但固氮酶會(huì)被氧氣不可逆地YZ。藍(lán)藻如何保護(hù)固氮酶不被光合作用放出的氧氣破壞？

l 如何直接觀測(cè)異形胞與營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞光合特性的差異？

從21世紀(jì)之初，隨著FKM多光譜熒光動(dòng)態(tài)顯微成像技術(shù)的提出和逐漸完善，科學(xué)家對(duì)藍(lán)藻異形胞光合特性的研究達(dá)到前人所不能企及的高度，甚取得了突破性的進(jìn)展。本文通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)案例展示這一研究發(fā)展的過(guò)程：

FKM多光譜熒光動(dòng)態(tài)顯微成像系統(tǒng)

1. 開(kāi)端：證實(shí)固氮和光合作用的時(shí)空隔離

FKM多光譜熒光動(dòng)態(tài)顯微成像技術(shù)于2000年正式提出并實(shí)用化，美國(guó)羅格斯大學(xué)Berman-Frank與德國(guó)康斯坦茨大學(xué)、捷克微生物研究所合作利用FKM技術(shù)對(duì)束毛藻Trichodesmium strain IMS101絲狀藻的光合特性進(jìn)行研究，對(duì)比固氮酶的活性與分布，發(fā)現(xiàn)固氮和光合作用從時(shí)間和空間兩方面被隔離開(kāi)了。他們推測(cè)在光合放氧進(jìn)化的早期階段，固氮酶是厭氧異養(yǎng)機(jī)制的一個(gè)電子受體，而光系統(tǒng)I（PSI）為固氮提供了厭氧的微環(huán)境。這一研究成果發(fā)表于2001年《Science》。

A.阿拉弗拉海的Trichodesmium spp. B.使用熒光顯微鏡和熒光二級(jí)抗體Alexa-350（分子探針）觀察到的固氮酶在藻絲上的分布 C.用一級(jí)抗體標(biāo)記固氮酶并通過(guò)共聚焦激光顯微鏡獲取的圖像 D.采集自阿拉弗拉海的T. erythraeum，褐色斑點(diǎn)表示固氮旺盛的13:30-14:30細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的H₂O₂的分布 E到H. Trichodesmium IMS101的葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)顯微成像 E和G. 光周期早期（00:00-04:00）的藻絲，此時(shí)的固氮作用很弱 F和H. 高固氮作用時(shí)的藻絲（進(jìn)入光周期后5-7小時(shí)）E和F. 相對(duì)葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)額成像圖，圖中可見(jiàn)在對(duì)應(yīng)時(shí)間里正常和明亮的藻絲（比如具有高熒光產(chǎn)額但Fv/Fm很低的藻絲）G和H. PSII效率Fv/Fm在藻絲上的假彩色二維分布圖

之后，他們又合作進(jìn)行更加深入的研究。通過(guò)FKM技術(shù)獲得的葉綠素?zé)晒獬上駡D與熒光淬滅動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)數(shù)據(jù)，再次表明束毛藻光合作用與固氮的協(xié)同作用涉及光合活性狀態(tài)可逆變化的復(fù)雜時(shí)空格局。 這些活性狀態(tài)提供了通過(guò)PSII的電子傳輸進(jìn)行固氮所需的協(xié)調(diào)和微調(diào)，并將光合放氧對(duì)固氮酶的YZ作用降ZD。這一研究發(fā)表于2004年《Plant Physiology》。

在這一研究結(jié)果通過(guò)葉綠素?zé)晒鈪?shù)小熒光F₀、可變熒光Fv等，已經(jīng)表明進(jìn)行固氮的藍(lán)藻細(xì)胞其PSII活性已經(jīng)極低，進(jìn)而喪失光合放氧能力。研究者也推測(cè)固氮與光合的時(shí)空分隔可能與異形胞有關(guān)。但此時(shí)的FKM技術(shù)尚不完善，獲得的顯微熒光成像圖不能明確區(qū)分絲狀體上的單個(gè)細(xì)胞，因此也沒(méi)能獲得進(jìn)一步的支持證據(jù)。

FKM技術(shù)獲得的藍(lán)藻Trichodesmium絲狀體細(xì)胞葉綠素?zé)晒獬上駡D與熒光淬滅動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)數(shù)據(jù)

2. 進(jìn)展：證實(shí)異形胞PSII功能特性

2007年，FKM技術(shù)迎來(lái)了一次全面升級(jí)。這次升級(jí)之后，FKM從原來(lái)主要測(cè)量微藻細(xì)胞，擴(kuò)展到能夠測(cè)量植物葉片細(xì)胞，同時(shí)顯微放大倍數(shù)與成像分辨率進(jìn)一步提升，能夠清晰分辨單個(gè)細(xì)胞乃單個(gè)葉綠體。

于是，捷克科學(xué)院和南波西米亞大學(xué)、德國(guó)康斯坦茨大學(xué)再次合作，使用升級(jí)后的FKM系統(tǒng)對(duì)魚(yú)腥藻Anabaena sp. strain PCC 7120異形胞進(jìn)行更深入研究。研究人員明確觀測(cè)到隨著氮素缺乏脅迫程度的加重，絲狀體細(xì)胞開(kāi)始分化，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和異形胞的葉綠素參數(shù)F₀、Fm、Fv等都逐漸下降，表明光合色素的下降。但這一過(guò)程中，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的ZD光化學(xué)效率Fv/Fm和持續(xù)電子流（量子產(chǎn)額）ΦPSII基本穩(wěn)定，表明其維持了PSII活性，但形成中的異形胞這兩項(xiàng)參數(shù)則顯著下降。更出人意料地，成熟的異形胞PSII天線(xiàn)色素含量顯著降低（F₀顯著降低），但其PSII本身卻是完整的（Fv/Fm恢復(fù)）。此，科學(xué)家終于直接觀測(cè)到異形胞PSII的分化過(guò)程與功能變化。

左圖：缺氮脅迫中營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞與異形胞的熒光參數(shù)變化；右圖：絲狀體逐個(gè)細(xì)胞的顯微熒光成像分析，其中7號(hào)和17號(hào)細(xì)胞為成熟的異形胞，箭頭所指為其對(duì)應(yīng)的熒光參數(shù)

3. 突破：異形胞也能夠維持藻膽素含量

之前的研究表明，為了維持固氮這一高耗能過(guò)程，藍(lán)藻異形胞主要通過(guò)光系統(tǒng)I（PSI）合成ATP為其功能。藻膽素雖然是藻類(lèi)光合重要的光合色素之一，但由于其主要作為PSII的天線(xiàn)色素，而PSII光合過(guò)程中通過(guò)放氧復(fù)合體釋放的氧氣會(huì)使固氮酶失活。因此異形胞雖然具備完整的PSII，但其藻膽素含量顯著下降，從而吸收的光能很少進(jìn)入PSII，使其失去光合放氧的能力，從而維持固氮酶活性。但這種機(jī)制的缺點(diǎn)是用于固氮的能量也由于藻膽素的缺失而受到限制。

美國(guó)華盛頓大學(xué)與PSI公司、中科院水生生物研究所合作，通過(guò)一種基因修飾系統(tǒng)對(duì)Anabaena 33047進(jìn)行處理。通過(guò)MC1000八通道藻類(lèi)培養(yǎng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)模擬不同波長(zhǎng)的高光培養(yǎng)環(huán)境，同步實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)其OD730，表明這種藍(lán)藻可以在高光條件下具有良好的適應(yīng)性。

左圖：不同光質(zhì)、光強(qiáng)、氮素營(yíng)養(yǎng)（A加氮B不加氮）的OD730生長(zhǎng)曲線(xiàn)；右圖：MC1000八通道藻類(lèi)培養(yǎng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)

通過(guò)特殊定制的FKM系統(tǒng)，研究人員直接測(cè)量了營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和異形胞的藻膽素?zé)晒?。結(jié)果表明，Anabaena 33047 ΔnblA突變株中異形胞的藻膽素?zé)晒馀c營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞接近，但野生型異形胞則遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于影響細(xì)胞。通過(guò)FKM熒光動(dòng)態(tài)分析，ΔnblA突變株異形胞的藻膽素?zé)晒馐且吧彤愋伟拇蠹s8倍高。這樣高含量的藻膽素，也就表明其可以為固氮過(guò)程提供遠(yuǎn)高于野生型的ATP，顯著提高其固氮能力。這一ZX研究成果發(fā)表于2021年《mBio》。

左圖（A-D）：Anabaena 33047 ΔnblA突變株與野生型的明場(chǎng)顯微圖與熒光顯微圖；右圖（E-G）：異形胞的藻膽素?zé)晒鈩?dòng)態(tài)分析

未來(lái)，科學(xué)家還會(huì)運(yùn)用FKM多光譜熒光動(dòng)態(tài)顯微成像技術(shù)在異形胞、微藻細(xì)胞分化領(lǐng)域確定什么樣的突破呢？請(qǐng)拭目以待。如果您希望了解更多關(guān)于FKM多光譜熒光動(dòng)態(tài)顯微成像技術(shù)的內(nèi)容，請(qǐng)聯(lián)系我們，或訪問(wèn)我們的官網(wǎng)搜索FKM：http://www.eco-tech.com.cn/

小球衣藻葉綠素?zé)晒怙@微成像分析，可見(jiàn)不同細(xì)胞之間的差異及葉綠素在細(xì)胞中的分布：左：小熒光F₀；中：ZD熒光Fm；右：ZD光化學(xué)效率Fv/Fm

參考文獻(xiàn)：

1. Berman-Frank I, et al. 2001. Segregation of Nitrogen Fixation and Oxygenic Photosynthesis in the Marine Cyanobacterium Trichodesmium. Science, 294: 1534-1537

2. Küpper H, Ferimazova N, ?etlík I, et al. 2004. Traffic Lights in Trichodesmium. Regulation of Photosynthesis for Nitrogen Fixation Studied by Chlorophyll Fluorescence Kinetic Microscopy. Plant Physiology, 135: 2120-2133

3. Ferimazova N, et al. 2013. Regulation of photosynthesis during heterocyst differentiation in Anabaena sp. strain PCC 7120 investigated in vivo at single-cell level by chlorophyll fluorescence kinetic microscopy. Photosynthesis Research, 116(1): 79-91

4. Bandyopadhyay A, et al. 2021. Antenna Modification Leads to Enhanced Nitrogenase Activity in a High Light-Tolerant Cyanobacterium. mBio, 12(6): e03408-21

北京易科泰生態(tài)技術(shù)公司提供藻類(lèi)培養(yǎng)與表型研究全面技術(shù)方案：

l AquaPen、FluorCam藻類(lèi)葉綠素?zé)晒?/span>/多光譜熒光技術(shù)

l SL3500、AlgaeTron/FytoScope智能LED光源與生長(zhǎng)箱

l SpectraPen/PolyPen、Specim高光譜測(cè)量技術(shù)

l FKM多光譜熒光動(dòng)態(tài)顯微成像系統(tǒng)

l FMT150藻類(lèi)培養(yǎng)與在線(xiàn)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)

l MC1000 8通道藻類(lèi)培養(yǎng)系統(tǒng)

l ET-PSI多功能藻類(lèi)培養(yǎng)與在線(xiàn)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)

l AlgaTech?高通量藻類(lèi)表型成像分析平臺(tái)