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天美講堂丨細(xì)數(shù)顯微拉曼光譜儀的那些“奇思妙想”

來源：天美儀拓實(shí)驗(yàn)室設(shè)備（上海）有限公司 更新時(shí)間：2024-07-24 17:45:12 閱讀量：283
導(dǎo)讀：顯微拉曼光譜儀是一種分析樣品化學(xué)成分的神奇技術(shù)，具有非破壞性，避免了樣品復(fù)雜的前處理以及染色過程。

顯微拉曼光譜儀是一種分析樣品化學(xué)成分的神奇技術(shù)，具有非破壞性，避免了樣品復(fù)雜的前處理以及染色過程。顯微拉曼光譜儀將拉曼光譜與顯微鏡相結(jié)合，獲得高空間分辨率，可用于幾微米的顆粒樣品測(cè)試。半導(dǎo)體、生命科學(xué)領(lǐng)域等多種應(yīng)用場(chǎng)景中，顯微拉曼光譜儀有著廣泛的應(yīng)用。

顯微拉曼光譜儀的光路示意圖

激光器部分(紅色)；顯微鏡部分(綠色)；光譜儀部分(藍(lán)色)

顯微拉曼光譜儀的工作“解密”

顯微拉曼光譜儀是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，由多個(gè)部分組成：光學(xué)顯微鏡、拉曼光譜儀、激光器和檢測(cè)器，如CCD(電荷耦合器件)相機(jī)。需要根據(jù)不同的應(yīng)用場(chǎng)景，選擇合適的配置。

激光器




激光器（光源）是顯微拉曼光譜儀中最重要的組件，通常在儀器配置時(shí)需要首先考慮。激光器的作用是激發(fā)樣品，產(chǎn)生拉曼光譜的分子振動(dòng)。

顯微拉曼光譜儀使用的激光器范圍通常從紫外到近紅外。兩種最常用的波長是532nm和785nm。

兩個(gè)波長（532nm和785nm）的激光器涵蓋了從工程材料到生物學(xué)領(lǐng)域的大多數(shù)應(yīng)用。例如，532nm的綠色激光器常用于材料方向（分析碳基樣品時(shí)可以運(yùn)用共振拉曼散射）；785nm的紅色激光器提供了拉曼散射強(qiáng)度和熒光背景干擾之間的最佳平衡。（當(dāng)選擇激光波長時(shí)，需要綜合考慮很多因素。）
拉曼散射強(qiáng)度與λ?4成正比，其中λ表示激光的波長。因此，隨著激光波長的增加，拉曼散射強(qiáng)度會(huì)減小。例如，紫外激光器提供的拉曼信號(hào)強(qiáng)度是近紅外激光器的15倍。532nm的激光器激發(fā)的樣品會(huì)產(chǎn)生比785nm的光激發(fā)樣品，更強(qiáng)烈的拉曼散射信號(hào)。
如果只考慮信號(hào)強(qiáng)度，532nm的激光器會(huì)有極大的優(yōu)勢(shì)。但激光的波長并不是唯一的考慮因素。如果樣品具有熒光特性，在測(cè)試樣品時(shí)，需要使用785nm的激光器，而不是532nm的激光器。當(dāng)532nm激光器激發(fā)樣品時(shí)，會(huì)觀察到高熒光背景，覆蓋拉曼散射信號(hào)。此時(shí)，光譜圖中的峰會(huì)變成一個(gè)大的、寬的、強(qiáng)度極高的峰（這會(huì)使檢測(cè)器飽和）。較少的分子吸收近紅外光，使用這個(gè)范圍內(nèi)的激光激發(fā)樣品，可以有效避免熒光干擾，并顯示拉曼峰。如果使用軟件功能幫助減少熒光干擾，在熒光強(qiáng)度非常高時(shí)，這種解決方法是有局限性的。
使用綠色激光器激發(fā)樣品時(shí)，提供高拉曼散射，允許更低的曝光時(shí)間和更短的實(shí)驗(yàn)時(shí)間。在測(cè)試綠色激光激發(fā)時(shí)表現(xiàn)出大熒光背景的樣品，需要選擇具有較低拉曼散射強(qiáng)度和較長實(shí)驗(yàn)時(shí)間的紅色激光。
激光對(duì)樣品的影響也是需要考慮的因素。長時(shí)間的曝光會(huì)增加樣品損壞的風(fēng)險(xiǎn)，用紅色激光激發(fā)樣品更有可能燒毀樣品，在測(cè)試這樣的樣品時(shí)，綠色激光成為更安全的選擇。
通過降低激光的功率可以降低樣品灼燒的危險(xiǎn)，但這也會(huì)降低散射強(qiáng)度，而紅光激光器的散射強(qiáng)度已經(jīng)相對(duì)較低了。一般來說，綠色激光更適合分析材料和無機(jī)樣品，而紅色激光更適合分析生物樣品。
要點(diǎn)提示：
1.532nm激光器比785nm激光器會(huì)產(chǎn)生更高的拉曼散射效應(yīng)；
2.增加激光波長可以降低熒光背景干擾的風(fēng)險(xiǎn)；
3.綠色激光器適合用于材料分析，紅色激光器適合生物科學(xué)方向的研究。

共聚焦顯微系統(tǒng)




將拉曼光譜儀與顯微鏡結(jié)合，以高空間分辨率對(duì)樣品進(jìn)行可視化和進(jìn)一步研究。拉曼掃描，也稱為拉曼成像，為多樣品點(diǎn)分析提供了優(yōu)勢(shì)?？梢蕴峁?duì)樣品內(nèi)部組成的分布和異質(zhì)性的信息，用于跟蹤藥物中的活性藥物成分以確保藥品質(zhì)量，或掃描半導(dǎo)體晶圓以查找缺陷。拉曼成像可以體現(xiàn)出在單點(diǎn)樣品光譜中可能不明顯的微觀特征信號(hào)，充分的數(shù)據(jù)信息可以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，幫助識(shí)別樣品內(nèi)的趨勢(shì)、模式和相關(guān)性。

使用顯微鏡和電動(dòng)樣品臺(tái)，樣品可以進(jìn)行拉曼掃描，建立拉曼成像。顯微共聚焦針孔位于光路上。針孔提高了空間分辨率，增加了圖像對(duì)比度，減少了熒光背景效應(yīng)。共聚焦針孔阻擋任何非聚焦光進(jìn)入光譜儀，防止不必要的散射或熒光到達(dá)檢測(cè)器。
共聚焦針孔進(jìn)一步提高了激光在z軸上的精確聚焦。允許用戶自由地測(cè)試樣品的表面信息；以及進(jìn)行三維樣品檢測(cè)，允許對(duì)單個(gè)樣品層進(jìn)行3D掃描。
顯微鏡允許配置許多物鏡，每個(gè)物鏡用于將激光聚焦到樣品上并收集產(chǎn)生的拉曼散射。物鏡有兩個(gè)重要參數(shù)：放大倍率和數(shù)值孔徑(NA)。增大放大倍率和NA可以提高空間分辨率。但，增大放大倍率會(huì)減小視野范圍。樣品的大小及其需要的分辨率是目鏡選擇的考慮因素。
要點(diǎn)提示：
1.共聚焦針孔有助于優(yōu)化空間分辨率；
2.共聚焦針孔有助于在Z軸方向的測(cè)試；
3.更高的放大倍率和數(shù)值孔徑物鏡增加分辨率，但降低視野寬度。

光路




光路是指樣品在激發(fā)后的拉曼散射方向（路徑）。如前所述，針孔在光路內(nèi)，截止濾光片也在光路通道內(nèi)（它可以防止瑞利散射進(jìn)入光譜儀）。瑞利散射無法提供有用的樣品信息，會(huì)妨礙拉曼散射的信號(hào)。

邊緣濾光片輪是用于捕獲和觀察拉曼散射的光學(xué)器件，是一種長通濾光片，可以吸收所有波長直至其光譜“邊緣”。例如，選擇邊緣為532nm的濾光片用于532nm激光器。濾光片吸收532nm及以下的光，其中包括該波長的瑞利散射。任何波長長于532nm的光都將通過濾光片傳輸?shù)焦庾V儀部分。
具有不同邊緣銳度的濾光片可以實(shí)現(xiàn)不同的光譜范圍。標(biāo)準(zhǔn)濾光片允許從~50cm?1觀察拉曼峰，對(duì)于一些特定的應(yīng)用，低波數(shù)濾光片可以觀察到從5cm?1起始的峰值，也有更高的波數(shù)起止的選項(xiàng)（更便宜的解決方案），但必須注意：不要濾除300~1900cm?1之間光譜指紋區(qū)域。

濾光片要點(diǎn)提示：

1.強(qiáng)瑞利散射不能提供有用的樣品信息；
2.邊緣濾光片阻擋了光譜儀的瑞利散射；
3.邊緣濾光片的銳度決定波數(shù)開始的位置。

光譜儀




光譜儀集成了光柵、攝譜儀和檢測(cè)器等組件。在顯微拉曼光譜儀中，衍射光柵將拉曼散射的波長分離并投射到具有不同像素的檢測(cè)器上。衍射光柵之間的主要區(qū)別是它們的刻線密度。具有較高刻線密度的光柵提供了更高的光譜分辨率。然而，光譜儀的光譜范圍與光柵的刻線密度成反比，這意味著較高的刻線密度也會(huì)降低光譜儀可以實(shí)現(xiàn)的光譜范圍。

光柵選擇的另一個(gè)因素是閃耀波長，它指的是衍射效率最高的波長。不同的光柵可以與特定的激光器配對(duì)，以提高衍射性能。
如何配對(duì)這些組件需要一定的理論考慮，例如：光譜分辨率隨著激光激發(fā)波長的減小而降低。因此，當(dāng)使用785nm激光器時(shí)，達(dá)到與532nm激光器相同光譜分辨率，使用低刻線密度的光柵即可。
光柵也有一個(gè)工作波長范圍（色散與波長有關(guān)）。刻線密度為n的光柵的理論波長極限計(jì)算為λ=2/n。因此，當(dāng)與532nm激光器配對(duì)時(shí)，2400刻線/mm的光柵將提供高光譜分辨率，但由于光譜范圍有限，它不適合與785nm激光器一起使用。
被光柵分光后，拉曼散射信號(hào)通過光譜儀。光譜儀的焦距也會(huì)影響系統(tǒng)的光譜分辨率：焦距越長（光的分散性越好），光譜分辨率越高。當(dāng)光傳播距離較長時(shí)，拉曼散射強(qiáng)度會(huì)降低。臺(tái)式共聚焦顯微拉曼使用200至250nm的光譜儀焦距。當(dāng)用紫外線激發(fā)或樣品需要非常高的光譜分辨率時(shí)，需要增加焦距（如大于500nm）。
光譜儀中檢測(cè)器將收集到的光子轉(zhuǎn)換成有意義的信號(hào)，提供樣品分子結(jié)構(gòu)的定性和定量信息。從實(shí)用的角度來看，檢測(cè)器的選擇通常依據(jù)顯微拉曼激光部分。電荷耦合器件(CCD)是拉曼顯微鏡中典型的檢測(cè)技術(shù)，這些硅基多通道一維或二維陣列探測(cè)器能夠快速捕獲整個(gè)光譜。CCD內(nèi)的每個(gè)通道都是一個(gè)光電二極管像素（其中有幾千個(gè)像素），產(chǎn)生的電子電荷與吸收光子的數(shù)量成正比。因此，在一定的時(shí)間內(nèi)到達(dá)CCD像素的光子越多，或者光子照射像素的時(shí)間越長，電荷會(huì)越多，檢測(cè)到的信號(hào)就越強(qiáng)。
有兩種類型的CCD：前照式和背照式（區(qū)別：入射光子如何到達(dá)光活性區(qū)）。在前照式的結(jié)構(gòu)中，光子撞擊與柵極電極在器件的同一側(cè)，柵極電極可以吸收或反射入射的光子。這種方法限制了到達(dá)光活性區(qū)域的光子數(shù)量，量子效率被限制在最高60%。
背照式CCD結(jié)構(gòu)中，光子透過薄薄的硅層到達(dá)傳感器的背面，可實(shí)現(xiàn)的較高的量子效率（高達(dá)95%），但背照式CCD在檢測(cè)時(shí)會(huì)存在光干涉的風(fēng)險(xiǎn)（近紅外區(qū)域）。一般來說，背照式CCD適合于可見光激發(fā)，而在近紅外范圍內(nèi)激發(fā)樣品時(shí)，建議選擇前照式CCD。
要點(diǎn)提示：
1.高刻線密度的光柵有利于提高光譜分辨率，但降低了光譜范圍；
2.較長的焦距有利于提高光譜分辨率，但降低信號(hào)強(qiáng)度；
3.前置式CCD適用于785nm的激發(fā)；
4.背照式CCD適用于532nm的激發(fā)。

總結(jié)

在獲得拉曼光譜的過程中，光從激光器進(jìn)入顯微鏡，通過光路，并最終進(jìn)入光譜儀時(shí)，多個(gè)組件發(fā)揮作用。確定顯微拉曼光譜儀的最佳配置是具有挑戰(zhàn)性的。樣本和具體的實(shí)驗(yàn)需求都是需要考慮的因素。理想的顯微拉曼光譜儀將為用戶提供足夠的通用性，以適應(yīng)各種實(shí)驗(yàn)需求。

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