質(zhì)譜技術(shù)的飛躍，正將生命科學(xué)研究推向單細(xì)胞層面的精準(zhǔn)探索。本研究突破性地利用 timsTOF Ultra與 4D-代謝組學(xué)工作流程，直擊藥用植物長春花（Catharanthus roseus）單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的生物堿化合物，不僅實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞代謝物的精準(zhǔn)檢測，更揭示了 4D 技術(shù)在未知化合物鑒定中的強(qiáng)大潛力。在單細(xì)胞的微觀尺度下，高分辨率質(zhì)量精度、PASEF技術(shù)分析能力與捕集離子淌度技術(shù)（TIMS）強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)手 —— 前者精準(zhǔn) “稱重” 分子，中者深度 “拆解” 結(jié)構(gòu)，后者巧妙區(qū)分 “同分異構(gòu)體” ，三者協(xié)同作用顯著提升研究效能。

實(shí)驗(yàn)方法

1、

單細(xì)胞分選

1) 根據(jù)參考文獻(xiàn)方法從長春花葉片中提取原生質(zhì)體（去除細(xì)胞壁的細(xì)胞）^[1,2]，利用CellCelector? Flex（Sartorius）細(xì)胞挑取裝置，對單個(gè)細(xì)胞成像、篩選后，轉(zhuǎn)移至含 5μL 0.1%甲酸水溶液的 96 孔板中。

2) 加入 7μL 含 20nM 阿義馬林（內(nèi)標(biāo)，IS）的甲醇裂解細(xì)胞；取 2μL 各細(xì)胞提取物混合，制備混合樣本。96 孔板以 1000×g 離心 2 min 后，分別取 4μL 細(xì)胞提取物及混合樣本注入系統(tǒng)進(jìn)行反相色譜分析。

實(shí)驗(yàn)方法

2、

LC-MS/MS 檢測

1)  采用 Agilent 1290 Infinity II 與 timsTOF Ultra 聯(lián)用系統(tǒng)，搭配 VIP-HESI離子源與PASEF技術(shù)，在正離子模式下進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，液相梯度時(shí)長為 7 min（表 1）。

2) 混合樣本通過 4D PASEF 模式獲取高可信度 MS/MS 數(shù)據(jù)，助力未知物鑒定。淌度范圍 (1/k0) 設(shè)置： 0.45-1.45V·s/cm²，Ramp time: 100 ms。針對單細(xì)胞提取物，在 120-1000 m/z 質(zhì)量范圍內(nèi)采集 3D 數(shù)據(jù)。

數(shù)據(jù)分析

使用 TASQ 2024b 定量細(xì)胞中 9 種關(guān)鍵生物堿化合物（表2）并計(jì)算其峰強(qiáng)度；使用 MetaboScape 2024b 軟件進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，評估混合樣本中可檢測到的 Feature 總數(shù)及具有對應(yīng)二級質(zhì)譜（MS2）數(shù)據(jù)的Feature總數(shù)。

 表 2. 單細(xì)胞分析中的目標(biāo)化合物

結(jié)果分析

1、

細(xì)胞亞型精準(zhǔn)分型

本研究對 168 個(gè)單細(xì)胞的分析顯示，9 種關(guān)鍵生物堿可明確區(qū)分三類細(xì)胞亞型：

• 異細(xì)胞（idioblast cell）：文多靈（Vindoline）作為異細(xì)胞（IB）亞型的特征性物質(zhì)，在 5 個(gè)細(xì)胞中被檢出^[1]；
  

• 表皮細(xì)胞（Epidermal Cell）：在 31 個(gè)單細(xì)胞中檢測到開聯(lián)番木鱉苷（Secologanin）^[1]，為生物堿合成提供早期前體；
  

• IPAP 細(xì)胞：馬錢苷酸（Loganic acid）在 2 個(gè)細(xì)胞中檢出，提示為長春花葉內(nèi)與韌皮部相關(guān)的薄壁細(xì)胞。

圖1. 長春花中異細(xì)胞、表皮細(xì)胞和IPAP細(xì)胞分離樣本圖像( E1、D5 和 D2 代表多孔板上的孔位)

 圖2. 長春花異細(xì)胞提取物中 6 種生物堿及內(nèi)標(biāo)Ajmaline的提取離子流圖（EICs）

結(jié)果分析

2、

代謝物的高可信度注釋

混合樣本經(jīng) 4D - 代謝組學(xué)方法（PASEF）分析，借助 TIMS 離子淌度排序結(jié)合同步CCS測量，實(shí)現(xiàn)了高頻率的前體離子選擇與碎裂；在此基礎(chǔ)上，利用 MetaboScape? 中的光譜數(shù)據(jù)庫（SL）和自定義目標(biāo)列表（TL，含有關(guān)鍵生物堿的保留時(shí)間及 InChI 結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)列表），最終可靠注釋出 133 種代謝物，為單細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)解析提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。以長春質(zhì)堿為例，對比參考譜圖（NIST 2020 MS/MS 光譜庫）與實(shí)測譜圖（基于 PASEF采集的MS/MS譜圖），MS/MS 得分為 970（滿分1000 分），表明注釋結(jié)果可靠（圖3）。

即便在缺乏參考 MS/MS 光譜數(shù)據(jù)的情況下，通過對目標(biāo)列表中已知結(jié)構(gòu)進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬碎裂（In-silico fragmentation），也能借助預(yù)測的碎片數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn)高可信度注釋。圖4 展示了代謝物的結(jié)構(gòu)、預(yù)測的 MS/MS 譜圖及碎片結(jié)構(gòu)。長春質(zhì)堿的實(shí)測CCS 值與預(yù)測 CCS 值的偏差為 0.5%，匹配度優(yōu)異；計(jì)算機(jī)模擬MS/MS碎裂的匹配得分達(dá) 948 分。綜上，利用機(jī)器學(xué)習(xí)算法CCS-Predict Pro（CCS預(yù)測技術(shù)）、計(jì)算機(jī)模擬MS/MS碎裂技術(shù)，結(jié)合碎片結(jié)構(gòu)可視化檢查，共同提升了該特征注釋為長春質(zhì)堿的可信度。            

結(jié)果分析

3、

4D 技術(shù)突破同分異構(gòu)體鑒定難題

 圖 6.   離子淌度有效分離代謝物（C??H??NO）在LC上共洗脫同分異構(gòu)體

結(jié)論

    

 timsTOF  Ultra 賦能單細(xì)胞代謝研究

1. timsTOF Ultra 平臺實(shí)現(xiàn)植物單細(xì)胞生物堿的可靠檢測，結(jié)合 4D-代謝組學(xué)工作流程可精準(zhǔn)分類細(xì)胞亞型并提升注釋可信度，成功注釋出 133 種代謝物。

2. 捕集離子淌度技術(shù) (TIMS) 有效區(qū)分共洗脫同分異構(gòu)體，顯著提升化合物鑒定的準(zhǔn)確性；
   

3. MetaboScape軟件：整合計(jì)算機(jī)模擬MS/MS譜圖碎裂（In-silico fragmentation）和 CCS 預(yù)測功能（CCS-Predict Pro），為未知化合物鑒定提供強(qiáng)大支撐。

參考文獻(xiàn)

[1] Li C, Wood JC, Vu AH, Hamilton JP, Rodriguez Lopez CE, Payne RME, Serna Guerrero DA, Gase K, Yamamoto K, Vaillancourt B, Caputi L, O’?onnor SE, Buell CR (2023). Single-cell multi-omics in the medicinal plant Catharanthus roseus. Nat. Chem. Biol. 19, 1031-1041.

[2] Vu AH, Kang M, Wurlitzer J, Heinicke S, Li C, Wood JC, Grabe V, Buell CR, Caputi L, O’Connor SE (2024). Quantitative single-cell mass spectrometry provides a highly resolved analysis of natural product biosynthesis partitioning in plants. J. Am. Chem. Soc. 146, 23891–23900.